目的建立以阳离子铝酞菁为红区荧光探针定量测定硫酸软骨素(CS)的新方法。方法在pH5.0的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液中,阳离子铝酞菁与CS发生相互作用形成离子缔合物而导致荧光猝灭。在610 nm波长光的激发下,随着CS的加入,探针的特征发射峰(676 nm)处的荧光强度逐步减弱。结果在最佳条件下,荧光强度差值(ΔIf)与CS浓度(C,μg/mL)在0.2~1.3μg/mL内呈良好的线性关系,工作曲线为ΔIf=406.67C-36.23,r=0.997。建立了溶剂沉淀法成功地进行了样品的前处理,实现了实际样品(滴眼液)的准确测定。结论该法简便、快速、抗金属离子及小分子干扰的能力较强,可用于复杂实际样品中CS的含量测定

尹璐

李东辉

王敬

邓雅斌

黄萍

Xiamen University Institutional Repository

阳离子铝酞菁红区荧光探针测定硫酸软骨素尹 璐，王 敬，黄 萍，邓雅斌，李东辉( 厦门大学 医学院 抗癌研究中心，福建 厦门 361005)摘 要:目的 建立以阳离子铝酞菁为红区荧光探针定量测定硫酸软骨素( CS) 的新方法。方法 在 pH 5． 0 的Britton-Robinson( B-R) 缓冲溶液中，阳离子铝酞菁与 CS 发生相互作用形成离子缔合物而导致荧光猝灭。在 610 nm波长光的激发下，随着 CS 的加入，探针的特征发射峰( 676 nm) 处的荧光强度逐步减弱。结果 在最佳条件下，荧光强度差值( ΔIf ) 与 CS 浓度( C，μg /mL) 在 0． 2 ～ 1． 3 μg /mL 内呈良好的线性关系，工作曲线为 ΔIf = 406． 67 C －36． 23，r = 0． 997。建立了溶剂沉淀法成功地进行了样品的前处理，实现了实际样品( 滴眼液) 的准确测定。结论该法简便、快速、抗金属离子及小分子干扰的能力较强，可用于复杂实际样品中 CS 的含量测定。关键词: 硫酸软骨素; 荧光分光光度法; 酞菁; 红区荧光探针; 含量测定中图分类号:O657． 3; R927． 3 文献标识码:A 文章编号:1005-1678(2011)04-0277-04Fluorimetric determination of chondroitin sulfate with cationic aluminumphthalocyanine used as a fluorescent probe emitting at red-regionYIN Lu，WANG Jin，HUANG Ping，DENG Ya-bin，LI Dong-hui( Cancer Research Center，School of Medicine，Xiamen University，Xiamen 361005，China)Abstract: Purpose To propose a novel method for quantitative determination of chondroitin sulfate( CS) in practical samples using cationic aluminum phthalocyanine as a fluorescence probe emitting atred-region．Methods It was found that the fluorescence of［Tetra( trimethylammionio) aluminum phthalo-cyaine］，a cationic red-region fluorescence probe，was extremely quenched by CS in acidic media，becauseof the formation of association complex between TTMAAlPc and CS． Based on this phenomenon，a newmethod was developed for quantitative determination of CS． Results Under the optimal conditions ( pH5． 0，a reaction time of 10 min，and at room temperature) ，the linear range of assay was 0． 2-1． 3 μg /mLand the detection limit was 0． 021 μg /mL． Establishing a solvent precipitation method for sample pre-treat-ment successfully，we achieve the accurate determination of actual sample ( eye drops) ． Conclu-sion Theconstructed method is not only accurate but also reliable． It has been used to the analysis of practical sam-ples( eyes-drops) with satisfied results，exhibiting the great potential for practical applications．Key words: chondroitin sulfate; fluorospectrophotometry; phthalocyanine; red-region fluorescenceprobe; assay收稿日期: 2011-04-06基金项目: 国家自然科学基金( No． 90206016，20015005) 和福建省公益类科研院所基本科研专项( No． 2010R1101)作者简介: 尹 璐，女，硕士研究生，从事生化分析研究; 李东辉，通信作者，Emai: Lidh@ xmu． edu． cn。硫酸软骨素 ( chondroitin sulfate，CS) 是从动物软骨中提取的酸性黏多糖。临床上用作骨关节炎和类风湿性关节炎的防治药物，具有抗凝血、抗肿瘤、抗关节炎等生理活性，在医学材料、保健品等领域的应用越来越引起人们的重视［1］。对冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病、骨关节炎等也有一定的疗效［2-3］。CS 常见的测定方法有高效液相色谱法［4］、比色法［5］、AHMT 分光光度法［6］、离子色谱法［7］、分光光度法［8］、高效毛细管电泳法［9］等。但上述方法尚存在一些不足之处，如对仪器和试剂要求较高，操作较为繁琐，精密度、准确度、抗干扰能力较低等。四取代三甲基碘化铵金属酞菁是一类阳离子染料，如中心配位元素为反磁性原子，则化合物具有红区发射的荧光特性，可有效避开背景荧光和散射光的772中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011 年第 32 卷第 4 期干扰，且光漂白作用小。酸性条件下，此类化合物带正电荷，易与带阴离子基团的生物大分子发生静电作用而形成离子缔合物。本文利用该类化合物的上述特点，以四取代三甲基碘化铵铝酞菁［Tetra( trim-ethylammionio) aluminum phthalocynine，TTMAAlPc］为红区荧光探针，在酸性介质中与 CS 发生结合反应，导致体系荧光强度降低，建立了 CS 荧光定量分析新方法。1 材 料TTMAAlPc 按文献［10］方法合成并纯化，配制1． 0 × 10 －3 g /mL 储备液。CS( 纯度 95% ) ，Sigma 公司; 复方 CS 滴眼液，山东博士伦福瑞达制药有限公司; 其他试剂均为分析纯，实验用水为高纯水。LS-55 荧光分光光度计，美国 PerkinElmer 公司;sbs 型 pH 计，美国奥立龙公司; Spectra Max M5-多功能酶标仪，美国 Molecular Devices 公司。2 方法与结果2． 1 测定方法0． 2 mol /L Britton-Robinson( B-R) 系列缓冲液:在浓度均为 0． 04 mol /L 的磷酸、乙酸、硼酸混合液100 mL 中加入一定体积的 0． 2 mol /L NaOH 溶液，即得相应 pH 值缓冲液。1． 0 mg /mL CS 储备液，4 ℃ 冰箱保存，工作液即用即配。在 5 mL 比色管中依次加入适量水、1． 0 × 10 －4g /mL TTMAAlPc 溶液、1 /10 体积 pH 5． 0 的 B-R 缓冲液、一定量的 CS 溶液，用水稀释至刻度，摇匀后于室温下静置反应 10 min。以试剂空白为参比，用3 mL 样品池在 676 nm 波长处测量不同浓度 CS 的荧光强度。试剂空白记为 If0，含有 CS 的记为 If，荧光强度差 ΔIf = If0 － If。2． 2 阳离子酞菁的分子结构和光谱特性TTMAAlPc( 图 1 ) 是一种具有类似卟啉结构的强荧光化合物，由于其外周的四个苯环上各有一强极性的阳离子基团，因而在水中的溶解度较大，便于实际应用。TTMAAlPc 的荧光发射峰( 676 nm) 处于红区( 图 2 ) ，其激发带有两个，一个位于紫外区称Soret 带; 另一个位于长波处，称 Q 带。如采用短波激发，将在其倍频处产生很强的二级散射 ( 散射峰在 700 nm 左右) ，故为避开此二级散射的干扰，激发波长选择在长波处 ( 610 nm) 。加入 CS 后，TT-MAAlPc 的荧光发生猝灭，但峰位置并未改变。阳离子金属酞菁易于与带有阴离子的生物大分子形成离子缔合物而发生减色效应与荧光猝灭现象［11］。CS 的分子骨架上带有酸性基团-COOH 和-SO3H，在弱酸性介质中，TTMAAlPc 与荷负电的 CS 发生相互作用而聚集，导致荧光猝灭，本文的方法即是据此荧光猝灭现象而建立。图 3 为 TTMAAlPc 与 CS 复合物在激发波长为610 nm，在 650 ～ 750 nm 范围内的荧光发射光谱图。在 pH 5． 0 的 B-R 缓冲液中，阳离子酞菁在 676 nm左右有最大发射波长( 图 3 曲线 1 ) 。加入 CS 后发生荧光猝灭，猝灭程度随 CS 加入量增大而增大( 图3 曲线 2 ～ 9) 。图 1 TTMAAlPc 的分子结构Fig． 1 Molecular structure of Tetra( trimethylammionio) alumi-num phthalocynine( TTMAAlPc)图 2 TTMAAlPc 的激发和发射波谱图Fig． 2 Emission and excitation spectra of TTMAAlPc1． 1． 0 × 10 －6 mg /mL TTMAAlPc + pH 5． 0 B-R 缓冲液; 2 ～ 9． CS 浓度分别为 0． 2，0． 3，0． 4，0． 6，0． 8，1． 0，1． 2，1． 3 μg /mL1． 1． 0 × 10 －6 mg /mL TTMAAlPc + pH 5． 0 B-R buffer; 2-9． The con-centrations of CS were 0． 2，0． 3，0． 4，0． 6，0． 8，1． 0，1． 2，1． 3 μg /mL re-spectively图 3 荧光发射光谱图Fig． 3 Fluorescence emission spectra of TTMAAlPc in the pres-ence of different concentrations of CS872 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011 年第 32 卷第 4 期2． 3 酸度的影响在 pH 2． 2 ～ 12． 0 的范围内，考察了体系 pH 对荧光强度变化的影响( 图 4) 。1． 0 × 10 －6 g /mL TT-MAAlPc 加不同 pH 值 B-R 缓冲溶液加浓度为 1． 0μg /mL 的 CS 溶液，溶液总体积 5 mL。可以看出，当pH 5． 0 时 ΔIf 值达到最大，故本文选用 pH 5． 0 的B-R 缓冲溶液，缓冲液用量为反应总体积的 1 /10。图 4 pH 值对荧光猝灭程度的影响Fig． 4 Influence of pH on the degree of fluorescence by CS2． 4 反应时间、温度和体系的稳定性考察了反应时间和温度对结合反应的影响，发现该反应的速度较快，室温下 10 min 即可达到平衡，且体系具有较好的稳定性，荧光强度值在 0． 5 h内维持恒定。2． 5 荧光探针用量的影响建立了不同 TTMAAlPc 探针浓度( 0． 5 × 10 －6，1． 0 × 10 －6，2． 0 × 10 －6，3． 0 × 10 －6 g /mL) 下的工作曲线。各浓度线性范围依次为 0． 08 ～ 0． 8，0． 2 ～1． 3，0． 6 ～ 2． 0，1． 5 ～ 6． 0 μg /mL。结果表明，TT-MAAlPc 浓度为 1． 0 × 10 －6 g /mL 时，工作曲线线性区间最大，灵敏度亦较好，故选择 TTMAAlPc 的最适浓度为 1． 0 × 10 －6 g /mL。2． 6 工作曲线在优化条件下，以 CS 浓度( C，μg /mL) 对 ΔIf 绘工作曲 线，得 线 性 回 归 方 程 为 ΔIf = 406． 68 C －36． 24，r = 0． 997，线性范围 0． 2 ～ 1． 3 μg /mL，检测限( 3σ) 为 0． 021 μg /mL。2． 7 共存物质的影响分别考察了常见金属离子、氨基酸等物质对体系的干扰( 表 1) 。可以看出，上述物质的存在对体系测定的影响不大，其相对误差在 ± 5． 0% 范围内。干扰实验结果表明，本法对上述物质的抗干扰能力要优于文献报道。DNA、蛋白质等生物大分子和表面活性剂的对结果干扰较大，这可能是由于它们参与对 TTMAAlPc 的竞争结合所致。2． 8 实际样品的测定表 1 常见干扰物对 CS 测定的影响( CS = 1． 0 μg /mL)Tab． 1 Influence of coexisting substances on the determination of CS( CS = 1． 0 μg /mL)物质名称 浓度 / ( mol /L) 相对误差 /% 物质名称 浓度 / ( μg /L) 相对误差 /%Mn + 1． 0 × 10 －5 1． 20 L-蛋氨酸 1． 0 0． 20Ba2 + 1． 0 × 10 －5 1． 10 L-组氨酸 1． 0 － 0． 28Pb + 1． 0 × 10 －5 2． 20 L-苯丙氨酸 1． 0 － 2． 80Zn2 + 1． 0 × 10 －5 1． 40 L-赖氨酸 1． 0 1． 40Al3 + 1． 0 × 10 －5 － 4． 60 L-白氨酸 1． 0 4． 60Mg2 + 1． 0 × 10 －5 － 1． 0 L-苏氨酸 1． 0 － 1． 10Ca2 + 1． 0 × 10 －5 － 0． 60 L-脯氨酸 1． 0 5． 70Cu2 + 1． 0 × 10 －5 1． 70 L-精氨酸 1． 0 2． 80β-CD 1． 0 × 10 －6 － 0． 83 人血清白蛋白 1． 0 3． 60SDS 1． 0 × 10 －6 2． 00 人血丙种球蛋白 1． 0 6． 20CTAB 1． 0 × 10 －6 － 6． 80 牛血清白蛋白 1． 0 5． 10Triton-100 1． 0 × 10 －6 － 1． 04 小牛胸腺 DNA 1． 0 7． 70CPB 1． 0 × 10 －6 7． 70 鲑鱼精 DNA 1． 0 6． 202． 8． 1 回收率试验 精密吸取已知浓度的滴眼液溶液 20 μL，9 份，置于 9 个 10 mL 量瓶中，分别加入0． 1 mg /mL CS 对照品溶液 20，40 和 60 μL 各 3 份，加水稀释至刻度，按 2． 1 项下方法测定含量，并计算回收率，结果分别为 105． 1%，100． 0%，110． 5%，107． 1%，107． 1%，108． 0%，107． 3%，107． 8% 和106． 2%，平均回收率为 106． 6%，RSD 为 2． 69% ( n= 9) 。2． 8． 2 样品测定 精密吸取 CS 滴眼液 1 mL，加入丙酮 2 mL，并用 5 mol /L NaOH 溶液 2 μL 调节 pH，摇匀，至沉淀不再增加，离心，取上清液，按 2． 1 项下方法测定。测得滴 眼 液 CS 含 量 为 0． 14 μg /mL，RSD 为1． 21% ( n = 9) 。3 讨 论本文建立了一种 CS 荧光定量分析新方法，具有准确、快速、方便的特点。采用的荧光探针 TT-MAAlPc 是一种阳离子酞菁化合物，水溶性好、量子产率高。其荧光发射位于长波( 红区) 波段，由于在此区域能发荧光的天然或合成的物质极少，且由于972中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011 年第 32 卷第 4 期散射光与波长的四次方成反比，因而，使用 TTMAAl-Pc 作为分子探针十分有利于避开试样背景荧光及散射光的干扰，从而提高测定的灵敏度和准确度。此外，由于可采用长波( 610 nm) 激发，光漂白作用小，有利于体系荧光的稳定。实际样品的测定是本文拟解决的重点问题，本文选择滴眼液为受试样品，其主要成分为 CS、维生素 E、维生素 B6、尿囊素、牛磺酸，另有辅料玻璃酸钠、硼酸、硼砂、冰片、薄荷脑、乙醇、吐温 80、三氯叔丁醇等。尤其是其所含的玻璃酸与 CS 同属黏多糖，结构具有相似性，实验表明其对 CS 的测定存在较为明显的干扰，因此需对样品进行前处理以消除干扰。文献推荐的分离二者的方法有: 溶剂分级沉淀、季铵盐表面活性剂沉淀、离子交换色谱、凝胶色谱、超滤、电泳［11］。本文采用溶剂分级沉淀法，这是因为溶剂沉淀法与季铵盐沉淀较为简便，但季铵盐对本法有一定干扰，而其余方法步骤较多，不利于实际应用。我们采用丙酮沉淀，并用 NaOH 溶液调节pH，成功地实现了玻璃酸与 CS 的沉淀分离，离心后取上清即可进行测定。操作简便、快速，具有较好的实用性，测定结果令人满意。参考文献:［1］ 卫生部药典委员会． 中华人民共和国卫生部药品标准( 二部)［S］． 第六册． 1998: 138-139．［2］ 刘 武． 硫酸软骨素药理作用研究进展［J］． 中国药业，2008，17( 8) : 64-66．［3］ 陈 磊，凌沛学，张天民． 硫酸软骨素在骨关节炎防治中的作用［J］． 中国生化药物杂志，2008，29( 2) : 137-139．［4］ Wayne K W，Kathleen G G，Andrew G B． Determination of chon-droitin sufate in nutritional supplements by liquid chromatography＆ Related Technologies［J］． J Liq Chrom Rel Technol，2000，23( 18) : 2851-2860．［5］ 董 明，曾正宏，陈桂阳． 比色法测定复方硫酸软骨素片中硫酸软骨素含量［J］． 中国生化药物杂志，2002，23( 4) : 191-192．［6］ Kunihiro K，Misako T，Kiyoshi T，et al． Spectrophotometric deter-mination 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对小鼠的免疫功能具有一定的正向调节作用，为其作用机制的阐明奠定了基础。参考文献:［1］ 蒋宏雷，施祥元，刘伟健． 毛蚶( Scapharaca subcrenata Lischke)人工育苗技术的初步研究［J］． 现代渔业信息，2006，21 ( 8 ) :21-23．［2］ 李 谦，李泰明，王香琴，等． 毛蚶提取物生化性质初步分析［J］． 药物生物技术，1998，5( 4) : 245-247．［3］ 何赟绵，陈宇星，刘纯慧，等． 毛蚶多糖的分离纯化和免疫活性测定［J］． 中国海洋药物 2007，26( 2) : 23-26．［4］ 王 莉，何赟绵，姚全胜． 毛蚶多糖免疫调节作用的实验研究［J］． 华西药学杂志，2009，24( 4) : 340-342．［5］ Song L Y，Ren S F，Yu R M，et al． Purification，characterizationand in vitro anti-tumor activity of proteins from Arca subcrenata Lis-chke［J］． Mar Drugs，2008( 6) : 418-430．［6］ 任胜芳，宋丽艳，严春艳，等． 毛蚶中抗癌活性肽高效液相指纹图谱分析研究［J］． 中药材，2008，31( 8) : 1134-1138．［7］ 李海瑞，吴希哲，徐韶瑜，等． 海洋真菌多糖( YCP) 对小鼠淋巴细胞免疫功能的影响［J］． 中国生化药物杂志，2007，28 ( 2 ) :91-93．［8］ 金丽琴，薛胜霞，吕建新，等． 牛膝多糖衍生物对小鼠脾淋巴细胞增殖及诱生 IL-2 和 TNF-α 的影响［J］． 中国生化药物杂志，2008，29( 5) : 312-314．［9］ 王翔岩． 肉从蓉多糖的免疫调节活性及吸收特性研究［D］． 北京: 北京协和医学院药用植物研究所，2009．［10］ 王 剑，蒲 蔷，何开泽，等． 川牛膝多糖的体外免疫活性研究［J］． 应用与环境生物学报，2008，14( 4) : 481-483．［11］ 季宇彬，高世勇，冯小燕，等． 甜菜碱促进小鼠脾淋巴细胞增殖作用的钙通道机制研究［J］． 中国中药杂志，2009，34 ( 15 ) :1959-1963．082 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2011 年第 32 卷第 4 期

阳离子铝酞菁红区荧光探针测定硫酸软骨素

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/18399/%e9%98%b3%e7%a6%bb%e5%ad%90%e9%93%9d%e9%85%9e%e8%8f%81%e7%ba%a2%e5%8c%ba%e8%8d%a7%e5%85%89%e6%8e%a2%e9%92%88%e6%b5%8b%e5%ae%9a%e7%a1%ab%e9%85%b8%e8%bd%af%e9%aa%a8%e7%b4%a0.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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