通过Western blot、体外捕获PCR、ELISA阻断实验及合成的多肽库等方法,对23株抗戊型肝炎病毒(HEV)单克隆抗体(单抗)识别HEV ORF2表位的作用进行系统研究。结果显示,7株线性单抗识别表位都位于ORF2 aa408~458之间,16株构象型单抗识别表位都定位于ORF2 aa459~606之间,大部分构象型单抗识别表位都在天然病毒表面。对这些单抗识别表位系统地了解将为HEV疫苗、诊断、病毒受体和病毒感染机制等方面的研究提供重要工具

史维国

夏宁邵

张军

杜海莲

熊君辉

苗季

葛胜祥

郭清顺

陈毅歆

顾颖

Xiamen University Institutional Repository

第24卷 　第2期2 0 0 8 年 3 月　　　　　　　　　　　　病　　毒　　学　　报CHIN ESE J OURNAL OF VIROLO GY　　　　　　　　　　　　 　Vol . 24 　No . 2March 　　2008抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究熊君辉 ,郭清顺 ,葛胜祥 ,顾颖 ,陈毅歆 ,苗季 ,杜海莲 ,史维国 ,张军 ,夏宁邵 3(厦门大学 　国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 , 厦门大学 　生命科学学院 , 福建 　厦门 　361005)摘要 :通过 Western blot、体外捕获 PCR、EL ISA 阻断实验及合成的多肽库等方法 ,对 23 株抗戊型肝炎病毒 ( H EV)单克隆抗体 (单抗)识别 H EV ORF2 表位的作用进行系统研究。结果显示 ,7 株线性单抗识别表位都位于 ORF2aa408～458 之间 ,16 株构象型单抗识别表位都定位于 ORF2 aa459～606 之间 ,大部分构象型单抗识别表位都在天然病毒表面。对这些单抗识别表位系统地了解将为 H EV 疫苗、诊断、病毒受体和病毒感染机制等方面的研究提供重要工具。关键词 :戊型肝炎病毒 ( H EV) ;单克隆抗体 (单抗 ,McAb) ;表位中图分类号 :R373 ; Q78 　　文献标识码 :A 　　文章编号 :100028721 (2008) 0220083205收稿日期 :2007206204 ;修回日期 :2007211225基金项目 : 863 计划 ( 2005DFA30820 ) ; 国家自然科学基金(30500092) ;国家自然科学基金 (30600106) ;福建省科技重大专项(2004 YZ0121) ;福建省科技创新项目 (2006F3124) 。作者简介 :熊君辉 (19802) ,男 ,博士研究生。通迅作者 :夏宁邵 ,361005 厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心。E2mail : nsxia @xmu1 edu1cn　　戊型肝炎病毒是戊型肝炎的病原体 ,为无包膜的单股正链 RNA 病毒 ,大小约为 27～34nm ,其表面有许多突起和缺刻结构。H EV 基因组有 3 个开放性阅读框 (ORFs) ,其中 ORF2 编码 660 个氨基酸的病毒衣壳蛋白 ,现有研究结果表明 H EV 的主要中和表位区域集中在 ORF2 的 aa459～606 之间[1 ] 。在大肠杆菌中表达 H EV 衣壳蛋白 ORF2 aa394～606 片段 ( E2)可以自发形成以二聚体为基础的多种聚合形式 ,类似于 H EV 衣壳蛋白的装配过程[ 2 ] ,且E2 免疫恒河猴具有良好的保护性[ 3 ] 。本实验室曾以 E2 为抗原制备了几株抗 H EV 单克隆抗体 ,其中8C11 和 8 H3 在体外能够捕获天然 H EV ,说明这两株单抗识别的表位位于 H EV 的表面 ;经恒河猴体内中和实验证明这两株单抗都具有中和活性 ,而且具有较明显的协同作用[4 ] 。另一项研究发现 8C11与 H EV 的结合引发 H EV 衣壳的空间结构改变 ,导致 8 H3 表位区域的充分暴露[5 ] 。E2 的 N 端延伸到aa368 的重组蛋白 H EV 239 可以形成类病毒颗粒 ,其抗原性与 E2 基本一致 ,但免疫原性显著提高[6 ] 。以 H EV 239 作为疫苗已完成了 II 期临床试验 ,即将开始 III 期临床研究。何水珍等[7 ] 发现 H EV 239可以阻断天然 H EV 对宿主细胞的吸附 ,提示 H EV239 较好地模拟了 H EV 表面的空间结构。本研究以 H EV 239 免疫并筛选出多株单抗 ,并对这一系列抗 H EV 单抗识别 H EV ORF2 抗原表位的作用进行系统研究 ,以期为 H EV 疫苗、诊断、病毒受体和病毒感染机制等方面的研究提供有力的工具。材料与方法1 　单抗 　单抗 8C11、8 H3、13D8、15B2 和 16D7 由 E2 抗原免疫 BALB/ c 小鼠制备 , 参见文献 [4 ] 。单抗 1A5、1 E8、2 G11、3B8、3 G3、4C10、6F8、8 E10、8 G12、12A7、12F12、12 G8、13 G9、2 G3、3 G4、3 G5、11 E8 和 12A10 由 H EV 239 抗原制备的 ,方法与文献 [4 ]相近。2 　重组蛋白 　重组蛋白 H EV 239 为大肠杆菌表达的 H EVORF2 aa368～606 , E2a [1 ] 为大肠杆菌表达的 H EV ORF2aa459～660。3 　免疫印迹实验( Western blot) 　E2a、H EV 239 及其沸水浴后的样品经 12 %的 SDS2PA GE 电泳后转移到硝酸纤维膜进行杂交 ;用 5 %脱脂奶封闭 2h ,加入一定比例稀释的单抗 ,反应 1h ;用 TN T 洗膜 3 次 ,每次 10min ;后加羊抗鼠碱性磷酸酶反应 1h ;用 TN T 洗膜 3 次 ,每次 10min ;用 NB T 和BCIP 显色。4 　线性单抗表位的定位 　根据 H EV 239 合成重叠 10 个氨基酸的 15 肽肽库共 46 条。以 0105mol/ L 碳酸盐包被缓冲液 (p H915)将每条多肽分别稀释成 1μg/ mL ,每孔 100μ包被于微孔板 ,37 ℃吸附过夜 ;用含有 0102 % Tween220 的 PBS(PBST)洗涤 1 遍 ,每孔 200μl 5 %的牛血清白蛋白 37 ℃封闭2h ;将封闭液甩干后 ,加入需要检测的单抗 37 ℃反应 30min ,用 PBST 洗涤 5 次并扣干 ;每孔加入 100μl HRP 标记的羊抗鼠 Ig G 37 ℃反应 30min ; PBST 洗涤 5 次并扣干 ,加入显色剂 ,37 ℃温育 10min ,终止 ,读取 OD450/ 620 nm 的读值。5 　ELISA阻断实验 　以改良过碘酸钠法标记各单抗 ,用EL ISA 法进行相互阻断试验。取每孔 0105μg/ mL H EV239 包被的 EL ISA 板 ,分为多组 ,每组两孔 ,一孔为阻断孔 ,加入 100μl 的不同单抗 (分别以 20 %小牛血清 PBS 稀释至EL ISA 滴度为 1 :105 ) ,另 1 孔为对照孔 ,仅加入 100μl 20 %小牛血清 PBS ; 37 ℃孵育 30min ;吸弃液体 ,每组分别加入100μl/ 孔辣根过氧化物酶标记的不同单抗 (以 20 %小牛血清PBS 稀释至 OD 在 110～ 115 之间) ; 37 ℃孵育 30min ; 用PBST 洗涤 5 次并扣干后 ,加入显色剂 , 37 ℃温育 15min ,2mol/ L 硫酸 50μl 终止反应 ,酶标仪上读取 OD450/ 620nm 的读值 ;计算阻断率 (阻断率 = 1 - 阻断孔 OD 值/ 对照孔 OD值) ,阻断率大于 50 %为阻断阳性。6 　捕获 PCR　用 PB 缓冲液 (p H714) 以 1 :500 稀释单抗 ,500μl 包被到经紫外照射 30min 的 Eppendorf 管中 ,37 ℃水浴过夜 ;1ml PBST 洗涤 1 次后用含有 015 %的 Casein 和 2 %的 Gelatin 的 PBS 37 ℃封闭 2h ;用 PBS 将含 H EV 的恒河猴粪便标本 (包括基因 1 型 xm25 和基因 4 型 xm33) 稀释成10 %的悬液 ,并通过 RT2PCR 定两种基因型的粪便悬液滴度 ,在 105 滴度 PCR 水平上各加 500μl 到 Eppendorf 管中 ,37 ℃温浴 2h ;用 800μl PBST 洗 10 次 ;然后进行 H EV RNA的提取和 RT2PCR ,参见文献 [8 ] 。结　　果1 　单抗识别表位的构象依赖性H EV 239 在 SDS2PA GE 上能呈现出聚体依赖性的构象型表位 ,样品经沸水浴后解聚成单体 ,只保留线性表位的活性 ,通过沸水浴与否的 H EV 239免疫印迹活性可以判断单抗表位的构象依赖性 (图1) 。结果7株单抗2 G3 、3 G4 、3 G5 、11 E8 、12 A 10 、15B2 和 16D7 对沸水浴与否的 H EV 239 具有相似的反应性 ,为线性单抗 ;另 16 株单抗只对未经沸水浴的 H EV 239 二聚体具有强的反应性 ,表明其识别表位的构象依赖性 , 这些单抗为 : 1A5、1 E8、2 G11、3B8、3 G3、4C10、6F8、8C11、8 E10、8 G12、8 H3、12A7、12F12、12 G8、13D8 和 13 G9。图 1 　免疫印迹实验分析单抗的构象依赖性Figure1 　Conformational dependency analysis ofanti2H EV McAbs through Western blotA. HEV239 ; B. Boiled HEV239 ;1. SDS2PA GE ;2. WBof conformational2dependent McAb1A5 ;3. WB of linear McAb 3 G5.2 　线性单抗识别 HEV抗原表位的确定分别以覆盖 H EV 239 全长的 46 条 15 肽为包被抗原 ,通过 EL ISA 分别与上述 7 株线性单抗反应 ,结果显示这些线性单抗识别的表位都位于 H EVORF2 aa408～458 之间 (图 2) 。图 2 　H EV ORF2 上的线性单抗识别区域Figure 2 　The recognition domain of linear McAbs on H EV ORF2The polypeptides recognized by linear McAbs were showed and t he cross2reactive sites were recogntion epitopes ofMcAbs. aa 459 - 606 (t he vertical line region) was t he recognition epitope of conformation2dependent McAbs.·48· 病 　　毒 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷 　3 　构象型单抗识别 HEV抗原表位的初步定位李少伟等[1 ] 发现中和单抗 8C11 与 H EV 239和 E2a 的聚体都有明显的反应 ,说明 8C11 的识别表位位于 H EV 239 和 E2a 的重叠部分 aa459～606。我们将所有构象型单抗与 H EV 239 和 E2a进行 Western blot 反应 ,结果显示所有构象型单抗的反应模式与 8C11 相同 ,说明所有构象型单抗识别的表位与 8C11 一样位于 aa459～606 之间 (表1) 。表 1 　单抗性质汇总Table 1 　The character of anti2H EV McAbsMcAbsWestern blotBoiled HEV 239 Unboiled HEV 239E2a Type &Capture2PCRHEV21 H EV248 E10 - + + C + +12A7 - + + C + +12F12 - + + C + +4C10 - + + C + +8 G12 - + + C + +12 G8 - + + C + +13 G9 - + + C + +1A5 - + + C + -1E8 - + + C + -3B8 - + + C + -3 G3 - + + C + -8C11 - + + C + -8 H3 - + + C + -13D8 - + + C + -6F8 - + + C - -2 G11 - + + C - -12A10 + + - L + -2 G3 + + - L - -3 G4 + + - L - -3 G5 + + - L - -11E8 + + - L - -15B2 + + - L - -16D7 + + - L - -　　&. L . Linear McAb ; C. Conformation2dependent McAb14 　构象型单抗间的相互阻断对 16 株构象型单抗进行交叉阻断实验 ,结果显示 :除 8 H3 单抗仅对另 2 株单抗有阻断外 ,其余 15株单抗均至少可阻断 9 株以上其他单抗 ,同时除8 H3 和 12F12 仅被 8 株单抗阻断外 ,其余 14 株单抗至少能被另外 10 株单抗所阻断 ,提示除 8 H3 单抗识别表位稍偏远一些外 ,另 15 株单抗的识别表位在空间上相互聚集 (图 3) ;另外 8 H3 的活性除了能被 8C11 明显增强外 ,还能被 3B8 增强。5 　单抗对 HEV的捕获作用23 株单抗分别包被 Eppendorf 管 ,分别对 1 株基因 1 型 H EV 和 1 株基因 4 型 H EV 进行捕获PCR 实验 ,结果 16 株构象型单抗中有 14 株能捕获病毒 ,提示 aa459～606 形成的免疫优势构象表位主要位于天然 H EV 表面 ,其中 7 株能同时捕获基因 1型 H EV 和基因 4 型 H EV (表 1) 。另外 ,有一株线性单抗 (12A10) 也能捕获病毒 ,提示该单抗识别的aa423～438 区域也暴露于病毒表面。讨　　论本研究发现所有线性单抗识别表位都位于ORF2 aa408～458 之间的区域 ,而构象单抗识别表位区域都位于 ORF2 aa459～606 之间 ,提示 H EV239 存在两个表位集中区域 ,aa408～458 主要以线性展开形式存在 ;而 aa459～606 为二聚体相互作用的折叠区域 ,形成众多由不连续氨基酸组成的构象型表位 ,该区域单抗绝大多数可捕获病毒 ,提示aa459～606 形成的折叠结构存在于病毒外表面。H EV 239 可以形成二聚体为基础的类病毒颗粒类。　　线性单抗 12A10 同样可捕获病毒 ,提示其识别的 aa 4 2 3～4 3 8区域也暴露于病毒表面。何水珍·58·　2 期 　　　　　　　　　　　熊君辉等 :抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究图 3 　构象型单抗间的相互阻断Figure 3 　Blocking result s among conformational anti2H EV McAbs图 4 　图示 H EV 239 识别表位区域Figure 4 　Graphical p resentation of H EV 239recognition epitopes等[6 ]发现 12A10 同样可以阻断 H EV 239 对细胞的吸附 ,缺失 aa424～438 区域之后对细胞的吸附能力有所减弱 ,提示该区域可能参与 H EV 与细胞的吸附过程。Xing 等[9 ]对 H EV VL P 的冰冻电镜分析显示 ,H EV 表面具有明显的突出、凹穴结构。由于 aa459～606 折叠结构形成了免疫优势表位以及相应单抗绝大多数都具有捕获病毒能力 ,该区域可能是 H EV表面突出部分的重要成分。14 株能捕获病毒的单抗中 ,有 7 株可捕获基因4 型 H EV ,提示基因 1 型 H EV 和基因 4 型 H EV表面具有很大的相似性 ,与目前认为 H EV 仅有一种血清型一致。然而 ,还另有 7 株单抗仅能捕获基因 1 型 H EV ,这是由于不同病毒株间的差异还是型之间的差异尚有待于进一步确证。参考文献 :[1 ]Li S W , Zhang J , He Z Q , et al1 Mutational analysis ofessential interactions involved in the assembly of hepatitisE virus capsid [J ] . J Biol Chem , 2005 , 280 (5) : 340023406.[2 ]李少伟 , 张军 , 何志强 , 等 1 大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒 Orf2 片段的聚合现象研究 [J ] . 生物工程学报 ,2002 , 18 (4) : 4632467.[3 ]葛胜祥 , 张军 , 黄果勇 , 等 1 大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒 Orf2 多肽对恒河猴的免疫保护研究 [J ] . 微生物学报 , 2003 , 43 (1) : 36243.[4 ]Zhang J , Gu Y , Ge S X , et al1 Analysis of hepatitis Evirus neutralization sites using monoclonal antibodies di2rected against a virus capsid protein[J ] . Vaccine , 2005 ,23 (22) : 288122892.[5 ]张军 , 顾颖 , 欧山海 , 等 1 戊型肝炎病毒衣壳蛋白中和表位间的构象诱导 [J ] . 病毒学报 , 2004 , 20 (2) : 1042109.[ 6 ]Li S W , Zhang J , Li Y M , et al1 A bacterially expressedparticulate hepatitis E vaccine : antigenicity , immunoge2nicity and protectivity on primates [J ] . Vaccine , 2005 ,23 (22) : 289322901.[7 ]何水珍 , 郑子峥 , 吴婷 , 等 1 戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究 [ J ] . 病毒学报 ,2006 , 22 (6) : 4262430.[8 ]葛胜祥 , 郭清顺 , 李少伟 , 等1 基因 Ⅰ、Ⅳ型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用 [J ] . 病毒学报 ,2005 , 21 (3) : 1812187.[9 ] Xing L , Kato K , Li T , et al1 Recombinant hepatitis Ecapsid protein self2assembles into a dual2domain T = 1particle presenting native virus epitopes [ J ] . Virology ,1999 , 265 (1) : 35245.·68· 病 　　毒 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷 　The Preliminary Analysis of the Recognition Epitopes of Anti2HEV MonoclonalAntibodies on HEV ORF2XION G J un2hui , GUO Qing2shun , GE Sheng2xiang , GU Ying , CH EN Yi2xin , MIAO Ji , DU Hai2lian ,SH I Wei2guo , ZHAN G J un , XIA Ning2shao( N ational I nst it ute of Diagnost ics and V accine Development of I n f ectious Disease andCollege of L i f e Science of X iamen Universit y , X iamen 361005 , China)Abstract :Western blot , capt ure2PCR , blocking EL ISA and synt hetic polypeptides were used to systemati2cally st udy t he recognition epitopes on H EV ORF2 of 23 anti2H EV monoclonal antibodies (McAbs) whichwere previously generated in our laboratory directed against H EV ORF21 Result s showed t hat sevenMcAbs recognized linear epitopes that located at aa4082458 of H EV ORF2 and 16 conformation2dependentMcAbs , most of which recognized t he surface epitopes of native H EV , located at aa4592606 of H EVORF21 The systematical st udy of t he recognition epitopes of anti2H EV McAbs on H EV ORF2 providesimportant information for t he investigation of virus receptor and H EV infection mechanism , as well as it svaccine and diagnostics develop ment .Key words : hepatitis E virus ( H EV) ; monoclonal antibody (McAb) ; epitopeCorres ponding author : X IA N ing2shao , E2mail : ns x ia @x mu. edu. cn※　　　　※　　　　※　　　　※　　　　※“病毒性肝炎 :成就与挑战”国际研讨会International Conference on Viral Hepatitis : Past Accomplishmentsand Unf ulf illed Quests( ICVH2008)　　“病毒性肝炎 :成就与挑战”国际研讨会( ICVH2008)经教育部批准将于 2008 年 4 月 15 日至 17 日在福建厦门举行 ( http :/ / nidvd. xmu. edu.cn/ icvh 2008. asp) 。此次会议由中国生物技术发展中心主办 ,由厦门市科技局、厦门大学、国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心、中国微生物学会病毒学专业委员会联合承办。会议由乙肝病毒发现者之一、美国科学院院士 Harvey J . Alter 担任大会主席 ,会议邀请在各型肝炎病毒的发现及预防领域做出重大贡献的科学家 Step hen M. Feinstone ,John L . Gerin 等做特邀报告。会议将回顾 60 年多来人类与病毒性肝炎斗争中取得的标志性成果 ,探讨现有科技水平下病毒性肝炎研究依然面临的关键科学和实践问题 ,预测病毒性肝炎研究发展的趋势 ,探讨发展中国家新发肝炎研究与防治策略 ,为未来病毒性肝炎基础及防治研究指引方向。会议将采取主题演讲与圆桌讨论相结合的方式 ,提供一个与世界各国科学家面对面交流的机会。欢迎在病毒性肝炎领域从事基础研究、临床研究、公共卫生、生物医药产业等方面的科学家、临床医生、卫生防疫工作者、企业技术骨干及科技决策部门、医疗卫生决策部门管理人员参加本次会议并投稿 ,会议论文一律用英文书写 ,把在病毒性肝炎研究领域取得的最新研究结果和技术方法等的论文和摘要 ,以 WORD 电子文档形式 , E2mail 至 hldu @xmu. edu. cn 和 jw2shih @xmu. edu. cn) 。·78·　2 期 　　　　　　　　　　　熊君辉等 :抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究

抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21202/%e6%8a%97%e6%88%8a%e5%9e%8b%e8%82%9d%e7%82%8e%e7%97%85%e6%af%92%e5%8d%95%e5%85%8b%e9%9a%86%e6%8a%97%e4%bd%93%e8%af%86%e5%88%ab%e8%a1%a8%e4%bd%8d%e7%9a%84%e5%88%9d%e6%ad%a5%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究

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