目的建立裸鼠食管癌移植瘤模型,探讨由RNAi诱导的EC9706细胞核干细胞因子(nucleostemin,NS)基因沉默对裸鼠移植瘤组织中EGF、EGFR基因表达的影响。方法裸鼠15只,采用STATA 8.0编制随机化分组程序,均分为3组,分别皮下注入pRNAT-U6.1-siNS2转染的EC9706细胞(siRNA干预组),pRNAT-U6.1-siC转染的EC9706细胞(无关siRNA对照组)以及正常EC9706细胞(空白对照组),接种5周,观察移植瘤生长情况,应用免疫组织化学方法和原位杂交技术检测裸鼠移植瘤组织中NS、EGF、EGFR基因蛋白和mRNA的表达。结果无关siRNA对照组及空白对照组第4天于接种部位出现肉眼可见的肿块,siRNA干预组于第6天在相应部位发现肉眼可见肿块,第5周各组裸鼠成瘤率均为100%。siRNA干预组、无关siRNA对照组及空白对照组裸鼠移植瘤组织中NS、EGF、EGFR蛋白和mRNA的阳性表达率比较差异显著(P<0.05)。相对于无关siRNA对照组和空白对照组,siRNA干预组裸鼠肿瘤组织中NS蛋白及mRNA的阳性表达率均降低。结论  EC9706细胞沉默NS基因可降低裸鼠体内EGF、EGFR基因的表达

关文池

吴卫东

张功员

张巧

李晟磊

Xiamen University Institutional Repository

论著 文章编号: 1000-5404( 2011) 13-1370-04沉默 EC9706 细胞 NS 基因对裸鼠移植瘤组织中 EGF、EGFR 基因表达的影响张功员1，关文池2，李晟磊3，张 巧1，吴卫东1 ( 450001 郑州，郑州大学: 公共卫生学院流行病学教研室1，基础医学院病理学教研室3 ; 361005 福建 厦门，厦门大学医学院临床医学系2 )［摘要］ 目的 建立裸鼠食管癌移植瘤模型，探讨由 RNAi 诱导的 EC9706 细胞核干细胞因子( nucleostemin，NS) 基因沉默对裸鼠移植瘤组织中 EGF、EGFR 基因表达的影响。方法 裸鼠 15 只，采用 STATA 8． 0 编制随机化分组程序，均分为 3 组，分别皮下注入 pRNAT-U6． 1-siNS2 转染的 EC9706 细胞( siRNA 干预组) ，pRNAT-U6． 1-siC 转染的 EC9706 细胞( 无关 siRNA 对照组) 以及正常 EC9706 细胞( 空白对照组) ，接种 5 周，观察移植瘤生长情况，应用免疫组织化学方法和原位杂交技术检测裸鼠移植瘤组织中 NS、EGF、EGFR 基因蛋白和 mRNA 的表达。结果 无关 siRNA 对照组及空白对照组第 4 天于接种部位出现肉眼可见的肿块，siRNA 干预组于第 6 天在相应部位发现肉眼可见肿块，第 5 周各组裸鼠成瘤率均为 100%。siRNA 干预组、无关 siRNA 对照组及空白对照组裸鼠移植瘤组织中 NS、EGF、EGFR 蛋白和 mRNA 的阳性表达率比较差异显著( P ＜ 0． 05) 。相对于无关 siRNA 对照组和空白对照组，siRNA 干预组裸鼠肿瘤组织中 NS 蛋白及 mRNA的阳性表达率均降低。结论 EC9706 细胞沉默 NS 基因可降低裸鼠体内 EGF、EGFR 基因的表达。［关键词］ 食管鳞状细胞癌; EC9706 细胞; RNA 干扰; 裸鼠; 核干细胞因子［中图法分类号］ R394． 3; R730． 23; R735． 1 ［文献标志码］ A［基金项目］ 河南省重点科技攻关基金( 72102310104) ; 河南省教育厅自然科学研究基金( 2007310017) ; 郑州市科技攻关基金( 064SGDS33218-28)［通信作者］ 张功员，E-mail: zgy@ zzu． edu． cnSilencing nucleostemin in EC9706 cells inhibits tumor growth and expression of EGFand EGFR in xenograft tumor in nude miceZhang Gongyuan1，Guan Wenchi2，Li Shenglei3，Zhang Qiao1，Wu Weidong1 ( 1 Department of Epidemiology，Public HealthCollege，2Department of Pathology，Basic Medical College，Zhengzhou University，Zhengzhou，Henan Province，450001; 3Department ofClinical Medicine，Medical College of Xiamen University，Xiamen，Fujian Province，361005，China)［Abstract］ Objective To investigate the effect of silencing nucleostemin ( NS ) in EC9706 cellsinduced by RNAi on the expression of epidermal growth factor ( EGF) and its receptor ( EGFR) ． MethodsFifteen nude mice were divided into three groups，each group contains five mice． Three different kinds of cells，EC9706 cells transfected by pRNAT-U6-1-siNS2，or by pRNAT-U6． 1-siC and normal EC9706 cells were injec-ted into the hypodermis tissues of corresponding mice respectively． Five weeks later after the injection，the sizesof xenograft tumors in these mice were measured，and the protein and mRNA expression of NS，EGF and EGFRin the xenograft tumor were detected by immunohistochemistry and RT-PCR． Results Visible tumors wereobserved in the injected position after 4 d in transfected pRNAT-U6． 1-siC and normal EC9706 cells groups，and after 6 d in transfected pRNAT-U6-1-siNS2 EC9706 cells group． In 5th week，the tumorigenesis were100% ． The protein and mRNA levels of NS，EGF and EGFR were lower in transfected pRNAT-U6-1-siNS2EC9706 cells group than in the other two groups ( P ＜ 0． 05 ) ． Conclusion Silencing NS of EC9706 cellsinhibits the growth of exnograft tumor in nude mice and decreases the expression of EGF gene and EGFR gene．Silencing NS gene may be a new strategy for the treatment of esophagus caicinoma．［Key words］ esophageal squamous cell carcinoma; EC9706 cells; RNA interference; nude mice;nucleosteminSupported by the Key Tackling Funds for Sci ＆ Tech Research of Henan Province ( 72102310104) ，the Natural Science Foundation of Department of Educationof Henan Province ( 2007310017) and the Tackling Foundation for Sci ＆ Tech Research of Zhengzhou City ( 064SGDS33218-28) ． Corresponding author: ZhangGongyuan，E-mail: zgy@ zzu． edu． cn0731第 33 卷第 13 期2011 年 7 月 15 日第 三 军 医 大 学 学 报J Third Mil Med UnivVol． 33，No． 13Jul． 15 2011在食管鳞状细胞癌的发生、发展及侵袭、转移过程中，核干细胞因子 ( nucleostemin，NS ) 发 挥 一 定 的 作用［1 － 3］。本课题组已成功构建了 1 组针对 NS 基因的siRNA 表 达 载 体，并 筛 选 出 最 强 的 干 扰 表 达 载 体pRNAT-U6． 1-siNS2，转染 EC9706 细胞后能抑制 NS 的表达［4］。EGF 和 EGFR 是近年来发现的在细胞增殖和分化中起重要作用的因子，可促进正常细胞的恶性转化及刺激肿瘤细胞的增殖［5］。EGF 和 EGFR 基因已成为近年来研究肿瘤发生、发展与细胞信号传导的新热点。研究表明食管癌组织中有 EGF 和 EGFR 的过表达［4，6］。为进一步了解沉默 NS 基因对裸鼠移植瘤组织中 EGF、EGFR 基因表达的影响，采用干扰表达载体 pRNAT-U6． 1-siNS2，转染 EC9706 细胞［4］，植入裸鼠皮下，观察其对移植瘤组织中 EGF、EGFR 基因表达的影响，为 NS 基因应用于食管肿瘤的治疗提供理论依据。1 材料与方法1． 1 实验材料1． 1． 1 细胞株 食管癌细胞株 EC9706，中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室赠。1． 1． 2 裸鼠 BALB /c 裸小鼠 15 只，雄性，4 周龄，体质量16 ～ 18 g，购自中科院上海斯莱克实验动物中心。饲养在恒湿( 相对湿度 40% ～60% ) 、恒温( 26 ～ 28 ℃ ) 的半屏障系统中，在河南省肿瘤病理重点实验室裸鼠培养室饲养。饮水及饲料均经灭菌处理，由郑州大学实验动物中心提供。全部实验饲养过程达到 SPF 级。1． 1． 3 EC9706 细胞的培养与转染 siRNA 干预组为转染pRNAT-U6． 1-siNS2 的 EC9706 细胞，无关 siRNA 对照组为转染pRNAT-U6． 1-siC 的 EC9706 细 胞，空 白 对 照 组 为 未 转 染 的EC9706 细胞［4］。1． 2 实验方法1． 2． 1 分组方法 采用 STATA 8． 0 编制随机化分组程序，将 15 只裸鼠随机分为 3 组，每组 5 只，用剪耳缘法标记，分为siRNA 干预组、无关 siRNA 对照组和空白对照组。分笼饲养。1． 2． 2 裸鼠异种肿瘤接种实验 大量扩增并收获处于对数生长期的 siRNA 干预组、无关 siRNA 对照组、空白对照组的EC9706 细胞，用不含 Ca2 +、Mg2 + 的 PBS 液( 0． 01 mol /L，pH =8． 0) 洗涤 2 次并制备成细胞悬液。每只裸小鼠背部肩胛旁区作为注射点，分别皮下注射各组细胞 2． 0 × 106。1． 2． 3 移植瘤大小观测 肉眼观察接种处新生物的生长情况。裸鼠在接种 5 周后，颈椎脱臼处死，冰上操作，迅速剪开皮肤，完整剥离肿块。肿瘤组织用 40 g /L 多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 μm 连续切片，拟行免疫组织化学法和原位杂交技术检测肿瘤组织中蛋白和 mRNA 的表达。1． 2． 4 裸鼠肿瘤组织中 NS、EGF、EGFR 基因蛋白和 mRNA 检测 免疫组织化学法检测裸鼠肿瘤组织中 NS、EGF、EGFR蛋白的 表 达［2，6］，原 位 杂 交 法 检 测 裸 鼠 肿 瘤 组 织 NS、EGF、EGFR mRNA 的表达，NS、EGF 和 EGFR 原位杂交 5＇端生物素标记、全硫代修饰探针由北京奥科生物技术有限责任公司合成。NS 探 针 序 列 为: 5'-CAGCAAAGCCAAGAAGCACCTGGAG-3';EGF 探 针 序 列 为: 5'-GAGGTCTTGCCCACACACAGTGCTGC-3';EGFR 探针序列为: 5'-CGATCCCCAGGGCCACCACCAGCAGC-3'。1． 3 统计学处理应用 SPSS 12． 0 统计软件处理数据。各组裸鼠移植瘤组织中 NS、EGF、EGFR 蛋白及其 mRNA 阳性表达率差异性比较采用行 × 列表的精确概率法。2 结果2． 1 EC9706 细胞株异种移植瘤动物模型的建立无关 siRNA 对照组、空白对照组裸鼠，经过 4 d 的成瘤潜伏期后，在其接种部位形成肉眼可见的肿块，而 siRNA 干预组裸鼠出瘤的时间较前 2 组延长 2 d。5 周 3 组裸鼠皮下均形成瘤体，3 组裸鼠成瘤率均为 100%。2． 2 裸鼠肿瘤组织中蛋白的表达2． 2． 1 NS 蛋白的表达 免疫组织化学检测结果显示，空白对照组、无关 siRNA 对照组可见到 NS 蛋白阳性染色，呈棕黄色颗粒，阳性信号定位于细胞核，而 siRNA 干预组裸鼠肿瘤组织未见到 NS 蛋白阳性染色( 图 1) 。空白对照组、无关 siRNA 对照组和 siRNA 干预组 NS 蛋白表达阳性率分别为 100% ( 5 /5) 、60． 0% ( 3 /5) 和 0( 0 /5) ，3 组间差异显著( P = 0． 009) 。2． 2． 2 EGF 蛋白的表达 免疫组织化学结果显示，空白对照组及无关 siRNA 对照组裸鼠肿瘤组织均可见到 EGF 蛋白阳性染色，呈棕黄色颗粒，阳性信号定位于细胞质，而 siRNA 干预组未见到 EGF 蛋白阳性染色( 图 1) 。空白对照组、无关 siRNA对照组和 siRNA 干预组间 EGF 蛋白阳性表达率分别为 100%( 5 /5) 、80% ( 4 /5) 和 0( 0 /5) ，3 组间差异显著( P = 0． 006) 。2． 2． 3 EGFR 蛋白的表达 免疫组织化学结果显示，空白对照组及无关 siRNA 对照组裸鼠肿瘤组织均可见到 EGFR 蛋白阳性染色，呈棕黄色颗粒，阳性信号定位于细胞质，而 siRNA 干预组未见到 EGFR 蛋白阳性染色 ( 图 1 ) 。空白对照组、无关siRNA 对照组和 siRNA 干预组间 EGF 蛋白阳性表达率分别为100% ( 5 /5) 、80% ( 4 /5) 和 0 ( 0 /5 ) ，3 组间 EGF 蛋白表达差异显著( P = 0. 006) 。2． 3 裸鼠肿瘤组织中 mRNA 的表达2． 3． 1 NS mRNA 的表达 原位杂交结果显示，阳性信号呈紫蓝色颗粒，定位于细胞质 ( 图 2 ) 。空白对照组、无关 siRNA对照组和 siRNA 干预组间 NS mRNA 表达阳性率分别为 100%( 5 /5 ) 、100% ( 5 /5 ) 和 20% ( 1 /5 ) ，3 组 间 差 异 显 著 ( P =0. 011) 。2． 3． 2 EGF mRNA 的表达 原位杂交结果显示，空白对照组及无关 siRNA 对照组裸鼠肿瘤组织均可见到 EGF mRNA 阳性表达，呈紫蓝色颗粒，阳性信号定位于细胞质，而 siRNA 干预组EGF mRNA 阳性表达率降低( 图 2) 。空白对照组、无关siRNA 对照组和 siRNA 干预组间 EGF mRNA 阳性表达率分别为 100%( 5 /5) 、100% ( 5 /5) 和 20% ( 1 /5) ，3 组间差异显著( P =0. 011) 。1731第 33 卷第 13 期2011 年 7 月 15 日第 三 军 医 大 学 学 报J Third Mil Med UnivVol． 33，No． 13Jul． 15 2011图 1 免疫组化染色检测裸鼠皮下移植瘤组织中蛋白的表达 ( SABC × 200)图 2 原位杂交法检测裸鼠移植瘤组织中 mRNA 的表达 ( LM ×400)2731第 33 卷第 13 期2011 年 7 月 15 日第 三 军 医 大 学 学 报J Third Mil Med UnivVol． 33，No． 13Jul． 15 20112． 3． 3 EGFR mRNA 的表达 原位杂交结果显示，空白对照组及无关 siRNA 对照组裸鼠肿瘤组织均可见到 EGFR mRNA阳性表达，呈紫蓝色颗粒，阳性信号定位于细胞质，而 siRNA 干预组未见到 EGFR mRNA 阳性表达( 图 2) 。空白对照组、无关siRNA 对照组和 siRNA 干预组间 EGFR 蛋白阳性表达率分别为 100% ( 5 /5) 、80% ( 4 /5) 和 0 ( 0 /5 ) ，3 组间阳性表达率差异显著( P = 0． 006) 。3 讨论NS 是 2002 年新发现的一个与细胞增殖相关的蛋白质，NS 蛋白可能是维持干细胞和癌细胞增殖所必需的蛋白质并使细胞保持在不分化状态［7 － 9］。其异常表达可能与多种实体肿瘤的增殖、分化密切相关［10 － 12］。国内有研究表明，沉默 NS 基因的表达可对 HL-60 白血病细胞有抑制增殖和促分化作用，改变了细胞的生物学性质，使细胞恶性程度有所减弱，并有可能诱发凋亡，在白血病的基因中具有潜在的临床价值［13］。本实验前期的研究结果显示: 食管鳞状细胞癌组织中存在NS 高表达，并且在食管鳞状细胞癌的发生、发展及浸润、转移过程中起着非常重要的作用［1 － 3］。为进一步了解沉默 NS 基因对 EC9706 细胞移植瘤生长的影响，将 siRNA 干预、空白对照及无关 siRNA 对照 3 组肿瘤细胞培养 后 分 别 种 植 于 裸 鼠 皮 下，结 果 发 现，无 关siRNA 对照组、空白对照组均于接种后 4 d 出现肉眼可见的瘤体，而 siRNA 干预组裸鼠出瘤的时间较前 2组延长 2 d。接种后 5 周，3 组裸鼠皮下均形成了瘤体，人食管癌 EC9706 细胞株异 种 移 植 成 功 率 达 到100%。结果提示皮下注射成瘤的方式建立人食管癌EC9706 细胞株异种移植瘤动物模型是成功的。采用免疫组织化学方法及原位杂交技术检测了不同组移植瘤组织中的 NS、EGF 和 EGFR 蛋白和 mRNA的表达，结果显示 siRNA 干预组、无关 siRNA 对照组及空白对照组裸鼠移植瘤组织中 NS、EGF、EGFR 蛋白和 mRNA 的阳性表达率差异均有统计学意义 ( P ＜0. 05) 。相 对 于 无 关 siRNA 对 照 组 和 空 白 对 照 组，siRNA 干预组裸鼠肿瘤组织中 NS 蛋白及 mRNA 的阳性表达率均降低，这就提示 pRNAT-U6． 1-siNS2 能从蛋白及 mRNA 水平特异性调节 NS 的表达，使 NS 基因沉默。NS 基因沉默之后，EGF、EGFR 蛋白及 mRNA的表达阳性率同样也存在显著下降的趋势，这就提示NS 基因沉默降低了移植瘤组织中 EGF 及 EGFR 基因的表达。综上所述，成功建立了裸鼠食管癌移植瘤模型，该裸鼠移植瘤模型可作为临床研究人食管鳞状细胞癌与NS 关系的动物模型。沉默 NS 基因可明显下调裸鼠移植瘤组织中 NS、EGF、EGFR 蛋白和 mRNA 的表达。参考文献:［1］ 张功员，陈萍萍，李晟磊，等． 食管鳞状细胞癌组织中核干细胞因子基因 mRNA 的表达［J］． 中华医学杂志，2008，88 ( 9 ) : 602 －605．［2］ 张功员，尹磊，李晟磊，等． 食管鳞状细胞癌组织中核干细胞因子蛋白和 mRNA 的半定量表达［J］． 中华肿瘤杂志，2008，30 ( 2 ) :125 － 128．［3］ 张功员，尹磊，李晟磊，等． 食管鳞状细胞癌组织中核干细胞因子、表皮生长因子和表皮生长因子受体 mRNA 的表达［J］． 解剖学报，2008，39( 6) : 862 － 866．［4］ 张功员，赵国强，尹磊，等． 核干细胞因子基因 siRNA 表达载体的构建及鉴定［J］． 南方医科大学学报，2008，28 ( 3 ) : 392 － 395，398．［5］ Yamada A，Saito N，Kameoka S，et al． Clinical significance of epider-mal growth factor ( EGF) expression in gastric cancer［J］． Hepatogas-troenterology，2007，54( 76) : 1049 － 1052．［6］ 尹磊，张功员，刘键，等． 食管鳞状细胞癌组织中 EGF 蛋白和mRNA 的表达［J］． 郑州大学学报: 医学版，2007，42 ( 6 ) : 1099 －1101．［7］ Lo D，Lu H． Nucleostemin: Another nucleolar“Twister”of the p53-MDM2 loop［J］． Cell Cycle，2010，9( 16) : 3227 － 3232．［8］ Tamase A，Muraguchi T，Naka K，et al． Identification of tumor-initia-ting cells in a highly aggressive brain tumor using promoter activity ofnucleostemin［J］． Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106( 40) : 17163 －17168．［9］ Tsai R Y． Nucleolar modulation of TRF1: a dynamic way to regulatetelomere and cell cycle by nucleostemin and GNL3L［J］． Cell Cycle，2009，8( 18) : 2912 － 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沉默EC9706细胞NS基因对裸鼠移植瘤组织中EGF、EGFR基因表达的影响

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/18391/%e6%b2%89%e9%bb%98EC9706%e7%bb%86%e8%83%9eNS%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e5%af%b9%e8%a3%b8%e9%bc%a0%e7%a7%bb%e6%a4%8d%e7%98%a4%e7%bb%84%e7%bb%87%e4%b8%adEGF%e3%80%81EGFR%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e8%a1%a8%e8%be%be%e7%9a%84%e5%bd%b1%e5%93%8d.pdf?sequence=1&isAllowed=y

沉默EC9706细胞NS基因对裸鼠移植瘤组织中EGF、EGFR基因表达的影响

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