以一株芘降解新鞘氨醇单胞菌(Novosphingobium pentaromativoransUS6-1)为模式菌株,为了追踪其在有芘和没有芘诱导下差异表达蛋白,对该菌株蛋白的超声破碎提取条件进行了优化.结果表明,在4℃环境下,功率为40 W,工作时间与间隔时间均为5 s,超声总次数为60次时菌体破碎效果最佳.与IEF(Isoelectric focusing electrophoresis)自制胶相比,IPG(Immobilized pHgradient)胶分离得到的蛋白点数量更多,质量更好.分析双向电泳图谱,追踪到至少7个在芘诱导条件下菌株US6-1表达的差异蛋白点.这说明芘可以诱导菌株US6-1合成特异蛋白.本实验结果为多环芳烃(PAHs)微生物代谢途径的阐明及环境中PAHs污染修复策略的制定提供了重要依据

田蕴

郑伟

郑天凌

黄君

Xiamen University Institutional Repository

第 47卷  增刊 22008年 12月厦门大学学报 (自然科学版 )Journal o f X iam en Un iversity ( N atura l S cience)Vo.l 47 Sup. 2Dec. 2008    收稿日期: 2008-10-05  基金项目:国家自然科学基金 ( 30530150, 40576054 ) ,国家基础科学人才培养基金项目 ( J0630640 ) ,国家基金委和教育部海洋环境科学创新团队研究计划 ( 40521003 ) ,福建省自然科学基金 ( 2008J0303 )资助  * 通讯作者: t ianyun@ xmu. edu. cn芘诱导下新鞘氨醇单胞菌差异表达蛋白追踪郑  伟1, 黄  君 1, 郑天凌1, 2, 田  蕴 1*( 1. 厦门大学生命科学学院, 2.近海海洋环境科学国家重点实验室 (厦门大学 ) , 福建 厦门 361005)摘要:以一株芘降解新鞘氨醇单胞菌 (Novo sphingobium pentaromativorans US6-1)为模式菌株, 为了追踪其在有芘和没有芘诱导下差异表达蛋白, 对该菌株蛋白的超声破碎提取条件进行了优化.结果表明, 在 4e 环境下, 功率为 40W, 工作时间与间隔时间均为 5 s,超声总次数为 60次时菌体破碎效果最佳.与 IEF ( Isoe lectr ic focusing e lectropho resis)自制胶相比,IPG ( Imm obilized pH gradient)胶分离得到的蛋白点数量更多, 质量更好.分析双向电泳图谱, 追踪到至少 7个在芘诱导条件下菌株 US6- 1表达的差异蛋白点. 这说明芘可以诱导菌株 US6-1合成特异蛋白.本实验结果为多环芳烃 ( PAH s)微生物代谢途径的阐明及环境中 PAH s污染修复策略的制定提供了重要依据.关键词:新鞘氨醇单胞菌; 芘降解;双向电泳中图分类号: X 172     文献标识码: A     文章编号: 0438-0479( 2008) S2-0049-05  多环芳烃 ( PAH s)是一类由 2个或 2个以上苯环组成的常见有机污染物,因其具有潜在的致癌、致畸和致突变毒性作用,引起学者的广泛关注[ 1-4 ].随着苯环数量的增加, 其脂溶性越强而水溶性越低, 致癌、致畸、致突变效应也随之增强. PAH s通过地球化学循环,在环境中广泛分布, 严重威胁着人类的健康[ 5].PAH s在环境中可通过多种途径得以降解, 包括挥发、光氧化、化学氧化、生物富集、土壤颗粒吸附、浸滤作用及微生物降解等[ 6]. 微生物修复 PAHs已成为治理该类污染物的最主要且最有效的途径之一[ 7 ].本研究优化了 N. p entaroma tivorans US6-1菌株蛋白的超声破碎提取条件,建立了双向电泳分析平台,进而研究菌株 US6-1在高环 PAH s-芘诱导前后的蛋白表达差异,以期在差异蛋白的分析基础上推导其对芘的代谢途径,所得研究成果必将丰富我们对芘的微生物代谢机制研究的认识.1 材料和方法1. 1 实验菌株实验菌株 N ovo sphingobium pentaroma tivorans stra inUS6-1[ 8], 由韩国海洋研究院提供.1. 2 试剂与培养基芘购自 S igma公司,纯度\ 99% ,甲醇、二氯甲烷、正己烷购于 TEDIA (美国 )公司, 均为 HPLC级, 蛋白胨、酵母浸出膏为 D if ico公司产品.芘 /二氯甲烷溶液配制: 称取芘 0. 1 g, 溶解于 10mL二氯甲烷,使其终浓度为 10mg /mL. 2216E培养基( 1 L ): 蛋白胨 5 g,酵母浸出膏 1 g,磷酸高铁 0. 01 g,陈海水 750 mL, 蒸馏水 250 mL, pH 7. 6~ 7. 8, 121e灭菌 20 m in.MM 2培养基 ( 1 L ): 硫酸亚铁 0. 278 mg, 1 mo l/L磷酸二氢钾溶液 0. 1 mL, 硫酸铵 2. 3 g, M CD 10 g, 陈海水 750 mL, 蒸馏水 250 mL, pH 7. 2, 121e 灭菌 20m in.第一向 IEF自制胶配方: U rea 0. 715 g, M illiQ水260 LL, 10% NP40 260 LL, 30A cr 175 LL, 40% Ampho-line 65 LL, AP 2. 6 LL, TEMED 1. 3 LL.第二向 SDS-PAGE胶配方:分离胶 (T = 12%, V = 56 mL) : 30% A cr 22. 4 mL,Tris-HC l缓冲液 ( pH = 8. 8) 14mL, M illiQ水 19. 6mL,10% SDS 0. 56 mL, 10% AP 0. 56 mL, TEMED 0. 056mL.浓缩胶 (T = 4%, V = 10 mL) : 30% A cr 1. 33 mL,Tris-HC l缓冲液 ( pH = 8. 8) 2. 5 mL, M illiQ水 6. 25mL, 10% SDS 0. 1 mL, 10% AP 0. 1 mL, TEMED 0. 02mL.1. 3 菌体活化与收集在无菌条件下将菌株 US6-1接种到 100 mL2216E液体培养基中, 30e 、150 g 振荡培养 24 h,# 50 # 厦门大学学报 (自然科学版 ) 2008年8 000 @ g离心 10 m in, 去上清收集菌体, 再用灭菌的MM 2液体培养基重悬后接种至芘诱导培养基与对照培养基中, OD 600为 0. 6, 30e , 150 g摇床中培养, 24 h后收集菌液.1. 4 菌体超声破碎将菌液 8 000 @ g离心 10m in, PBS缓冲液重悬洗涤 3次,所得菌体重溶于适量的 PBS缓冲液中, 配成一定浓度的菌悬液用于菌体超声破碎.超声条件为:功率 40~ 200W, 超声 5 s,间隔 5 s,总时间为 10m in.1. 5 镜检超声破碎效果取上清液涂片, 干燥固定后加结晶紫染色 1~ 2m in,水洗,用碘液冲去残水, 覆盖约 1 m in, 水洗, 滤纸吸去玻片上的残水, 加 95%的乙醇脱色, 水洗干燥后显微镜 40倍观察.1. 6 菌体蛋白样品收集超声结束后 4e , 15 000 @ g离心 20 m in, 吸出上清, 3倍体积预冷丙酮于 - 20e 沉淀 4 h或过夜, 4e ,15 000 @ g离心 20m in,去上清,风干沉淀,按质量浓度为 1B20加入蛋白裂解液 (即 1 mg样品加入 20 LL裂解液 ), 用 Brad fo rd法测定蛋白含量, - 20e 保存用于双向电泳.1. 7 双向电泳分析1. 7. 1 IEF自制管胶等电聚焦按配方灌制 2根长 14 cm的柱胶, 预电泳 200 V15 m in, 300 V 30m in, 400 V 45 m in, 预电泳结束后,按下列程序聚焦电泳: 500V 30m in, 600V 30m in, 700V30 m in, 800V 12 h, 1 000V 30m in.电泳后的 IEF胶条迅速转移到凝胶平衡液中, 在摇床上平衡 20 m in. 将IEF胶条平衡后小心地放置在浓缩胶顶部,用 1%琼脂糖 (用电极缓冲液配制, 含 0. 002%溴酚蓝 )封顶固定.电泳参数为每块胶恒流 16 mA至溴酚蓝到达分离胶界面, 加大电流,以每块胶 24 mA电泳至溴酚蓝前沿到距离胶底边约 1 cm处 (约 6 h)1. 7. 2 IPG胶条等电聚焦采用 13 cm长的 IPG胶条, 加入 250 LL水化液( 1. 25 LL IPG-buffer+蛋白样品 +水化液储备液 ). 等电聚焦条件: 30 V 16 h、100 V 1 h、200V 1 h、500 V 1h、1 000V 6 h、8 000V 3 h、8 000V至电泳总伏时数达20 000 V# h.将 IPG胶条放入平衡试管内,先加入 10 mL含有0. 1 g DTT的平衡液,摇床上振荡平衡 15 m in.倒掉平衡液, 加入 10 mL含有 0. 25 g碘乙酰胺的平衡液, 平衡 15m in.胶条经电泳缓冲液润洗后转移至 12%分离胶上,排出气泡, 琼脂糖封顶. 电泳条件为: 25 mA 40m in, 50 mA至电泳结束.1. 7. 3 染色及扫描采用银染法[ 9]染色,染色后利用 G IS-2008凝胶成像分析系统分析.2 结果与讨论2. 1 菌体蛋白提取方案的优化2. 1. 1 不同超声功率下菌液蛋白浓度的测定结果样品制备是双向电泳成功与否的关键.超声破碎法是菌体蛋白制备中常用的一种菌体破碎方法. 该方法以操作简便,破碎效率高而得到广泛的使用.由于不同的实验参数会对破碎的效果产生不同程度的影响,所以有必要针对实验对象优化超声过程中的各个参数.本实验以破碎后菌液中蛋白的浓度为指标,比较了在 4e 条件下不同功率的超声对浓度为 90 mg /mL菌液的破碎效果. 结果如图 1所示, 以 80W 功率超声时,菌液中蛋白浓度最高. 由此可以推测,该超声功率具有较好的菌体蛋白提取效果.图 1 不同功率超声破碎后 US6-1菌体蛋白浓度F ig. 1 P rotein concentration o fUS6-1 in diffe rent pow er2. 1. 2 不同功率下菌体破碎效果的镜检图 2表示在不同功率超声作用下菌液破碎状态的镜检结果,图 2-a表明当超声功率为 40W 时, 菌液中仍有很多较大的菌体颗粒存在,说明破碎不完全,而当超声功率提高到 80W以上时, 则菌体细胞破碎较为完全, 见图 2-b.综合 2. 1. 1的结果,可确定超声功率为80W为佳.2. 1. 3 不同超声时间对菌体蛋白双向电泳分离效果的影响  超声时间也能影响菌体蛋白的提取效果. 超声时间过短,菌体破碎不完全, 菌体蛋白不能完全被释放出来;超声时间过长,则会由于超声过程中的放热作用导致蛋白的变性失活. 这些都会对双向电泳分离效果产生影响. 故运用双向电泳技术检测不同超声时间下蛋增刊 2 郑  伟等:芘诱导下新鞘氨醇单胞菌差异表达蛋白追踪 # 51 #白提取的效果也是必要的.图 3比较了在 80W, 5s /5s超声条件下, 超声时间分别为 10 m in (图 3-a)与 15m in (图 3-b)时, 菌体蛋白的分离效果.结果表明,在保证菌体破碎完全的前提下, 缩短超声时间可以有效抑制蛋白质变性,提高凝胶的分辨力.2. 2 蛋白载样量对双向电泳分离效果的影响进行蛋白质电泳,需对所分析的样本进行定量,以保证合适的蛋白质载样量, 过大或过小的载样量都会影响电泳效果.另外, 通过定量可使不同样本的载样量完全相同,有利于对相似的样本进行比较.本实验比较不同载样量对 IEF自制胶分离效果的影响, 见图 4. 其中图 4-a的样品蛋白上样量为 10 Lg, 图 4-b中蛋白上样量为 60 Lg.对比两块凝胶, 图 4-b凝胶中蛋白点的丰度更高,分布更均匀.但是仍有大量的蛋白无法充分分离,分析其原因,主要是由于 IEF自制胶自身不足造成的.与相同长度的 IPG胶相比, IEF自制胶的所能分离最大蛋白载样量较小,其 pH梯度也不稳定,较高的电压会破坏胶内形成的 pH梯度并导致胶条变型, 这些因素都会降低 IEF自制胶的分辨力.# 52 # 厦门大学学报 (自然科学版 ) 2008年2. 3 芘诱导下 US6-1差异蛋白的分析为了克服 IEF自制胶分辨力不足的缺点,我们改用 IPG胶条电泳分离菌株 US6-1的菌体蛋白, 结果见图 5,凝胶上可清晰分辨蛋白点超过 400个, 背景也比较干净,且实验重复性较好.在此基础上,运用双向电泳技术分析了菌株 US6-1在芘诱导前后的蛋白表达,在 pH范围为 4~ 5. 5之间实验组凝胶上 (图 6-b)发现 7个在芘诱导下表达的差异蛋白,这些蛋白在对照组 (图 6-a)中并不存在, 如方框所示.因此推测这几个蛋白可能与芘的降解有关,需进一步应用质普技术进行分析.图 5 US6-1的 2-DE( IPG )分析F ig. 5 2-DE( IPG ) profile o fUS6-1  图 6 芘诱导下菌株 US6-1的蛋白表达差异  F ig. 6 Differential pro te ins express ion o f stra in US6-1 induced by py rene3 小  结本实验优化了超声破碎提取 U S6-1菌体蛋白的方法,该方法不仅可以有效地保护菌体蛋白活性,也提高了双向电泳的分辨率. IEF管胶对高丰度的蛋白的分离效果不好,而借助 IPG胶条可以改善这一点,与此同时, IPG胶条具有更好的可重复性. 利用 IPG胶条, 成功地追踪到 7个在芘诱导条件下大量表达的菌体蛋白.在获得差异蛋白的序列信息后, 可以其为模板设计 PCR引物,扩增出相关基因序列, 再导入宿主微生物体内,构建出具有高效芘降解功能的环保微生物,应用于 PAHs环境污染的微生物修复工作. 同时,可以进一步研究菌株降解芘时的调控机制, 为揭示 PAHs生物降解的分子机制打下理论基础.参考文献:[ 1] Huntley S L, Bonnev ie N L, W enn ing R J. Po lycyc lic a ro-m atic hydro ca rbon and pe tro leum hydrocarbon contam ina tionin sed im en t from the New ark Bay Estua ry, N ew Je rsey [ J].A rch Env iron Conta in Tox ico,l 1995, 28: 93- 107.[ 2] F ismes J, P errin-Ganier C, Empereur-B issonne t P, et a.lSo i-l to- root transfer and translocation of po ly cyc lic arom atichydrocarbons by vegetab les grown on industria l contam inatedso ils[ J]. J Env iron Qua,l 2002, 31( 5) : 1649- 1656.[ 3] M atscheko N, Lundstedt S, Svensson L, et a .l Accumu la tionand elim ina tion of 16 po lycyclic a roma tic compounds in theea rthworm ( E iseniafetida ) [ J] . Env iron Tox ico l Chem,2002, 21( 8): 1724- 1729.[ 4] Zhou J L, M askaou i K. 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Journa l o f System atic andEvolutionaryM icrob io logy, 2004, 54: 001- 006.[ 9] 郭尧君. 蛋白质电泳实验技术 [ M ]. 北京: 科学出版社,1999.Using Two-dimensional ( 2D) Electrophoresis to Detect Pyrene-inducedProteins inNovosphingobium pentaromativorans US6-1ZHENGW ei1, HUANG Jun1, ZHENG T ian-ling1, 2, T IAN Yun1*( 1. Schoo l of L ife Sc ien ces, X iam enU niversity,2. S tateK ey L aboratory forM ar ine Env ironm en tal Sciences(X iamenUn iversity ), X iam en 361005, Ch ina)Abstract: The cond ition of ce ll broken by son ication inNovosph ingobium pen tarom ativorans U S6-1 w as optmi ized in order to get the totalproteins. Tw o-dmi ensional ( 2D) gel elec trophore sis of pyrene-induced protein s from cu ltures of strain US6-1w as used to detect prote ins th atin creased after pyrene expo su re in th is study. The results show that cells w ere broken w ell by son ication under the condition s of treatm enttmi e 5 s w ith 5 s in tervals, 60 tmi es at 4e . The prote in spo ts separated by IPG gelw erem ore and clearer than that by IEF ge.l Comparisonof prote ins from pyrene-induced and unindu ced cultures on 2D gels indicated that at least sevenm ajor pro tein sw ere expressed. These resu ltsprovided eviden ce that pyrene induces the syn thesis of spec ific pro tein s in strainUS6-1. The presen t study y ie lded mi portan t inform ation th atw ou ld be usefu l in analyzing PAH s degradation pathw ay and mi proving environm en tal c lean-up strateg ie s for PAH s.Key words: N ovosph ingobium p en taromativorans US6-1; pyrene-induced prote ins; tw o-dmi ensional electropho resis

芘诱导下新鞘氨醇单胞菌差异表达蛋白追踪

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/26009/%e8%8a%98%e8%af%b1%e5%af%bc%e4%b8%8b%e6%96%b0%e9%9e%98%e6%b0%a8%e9%86%87%e5%8d%95%e8%83%9e%e8%8f%8c%e5%b7%ae%e5%bc%82%e8%a1%a8%e8%be%be%e8%9b%8b%e7%99%bd%e8%bf%bd%e8%b8%aa.pdf?sequence=1&isAllowed=y

芘诱导下新鞘氨醇单胞菌差异表达蛋白追踪

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