从有机磷农药污染地区分离到 14株具有高效甲胺磷降解活力的细菌 ,并用HPLC对其降解效率进行分析 ,发现一周内降解率最高达 74 % .采用3 1PNMR对其降解产物进行了同步监测 ,发现其降解产物不同 ,其中有三株可以把甲胺磷代谢成磷酸 .这三株降解细菌可以从环境中有效的清除有机磷的污

倪锋

王建峰

胡利明

许鹏翔

赵玉芬

路杨

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 2004年 3月 4日收稿 1 * 福建省重大科技项目 ) ) ) 福建沙溪微生物资源在环境保护和药物开发中的利用( 2000h011 ) . 31P NMR与HPLC联用筛选高效有机磷降解细菌*路  杨1  倪  锋1  许鹏翔1  王建峰1  胡利明1  赵玉芬1, 2( 1  厦门大学化学系, 化学生物学福建省重点实验室, 厦门, 361005;2  清华大学化学系, 生命有机磷化学与化学生物学教育部重点实验室, 北京, 100084 )摘  要  从有机磷农药污染地区分离到 14株具有高效甲胺磷降解活力的细菌, 并用H PLC 对其降解效率进行分析, 发现一周内降解率最高达 74% . 采用31P NMR对其降解产物进行了同步监测, 发现其降解产物不同, 其中有三株可以把甲胺磷代谢成磷酸. 这三株降解细菌可以从环境中有效的清除有机磷的污染.关键词  甲胺磷, 降解, HPLC, 31P NMR.  甲胺磷( methamidophos, MAP )化学名称为 O, S-二甲基硫赶磷酰胺. 是一种高效广谱的杀虫剂,其在水体、土壤中的累积对生态环境和人类健康造成很大的威胁. 从污染环境中筛选高效实用的降解菌株, 在解除甲胺磷污染的同时, 清除水环境中的有机磷, 防止水体的富营养化[ 1, 2] .  本文采用31P NMR与HPLC 联用技术, 从有机磷农药污染环境中筛选出高效的降解菌, 同时对不同菌株的降解产物进行监测.1  实验部分111  菌株的采集  菌株采集于福建省三明市沙溪污染河段及农药厂: ( 1 )三化总口污泥, ( 2 )渣厂 NaCl堆积池污泥, ( 3 )生化池一级及二级池混合污水, ( 4 )黄磷口污水, ( 5 )生化池污泥, ( 6 )渣厂渗滤液.  基础培养基: NaCl 012g, KCl 012g, 无水 MgSO4 012g, NH4NO3110g, 纯净水 1000ml富集培养基: 在 1000ml基础培养基中, 加入酵母膏 5g, NaCl 5g, 胰化蛋白胨 10g, LB固体培养基.112  菌株的分离  取土样 5g, 水样 10ml, 分别接种到80ml甲胺磷浓度为 100mg #l- 1的基础培养基( pH710 )中, 置于 120r #min- 1的摇床中培养( 35 e ) . 一周后, 取 10ml接入 90ml甲胺磷浓度为 200 mg #l- 1的基础培养基中. 以后每一周移种一次, 依次在 400, 800 mg #l- 1的浓度下再培养一周. 在含有 800 mg #l- 1甲胺磷的 LB固体培养基上涂布菌液, 35 e 温箱中培养一夜, 再划线培养, 直至挑出单菌落[ 3, 4] .113  甲胺磷降解率的检测  将单菌落接种入装有 5ml富集培养基( pH710, 甲胺磷含量为 500 mg #l- 1)的螺口试管, 置于 120r#min- 1的摇床中培养一夜( 35 e ) . 每株按照 10%的接种量, 接入甲胺磷含量为 2000 mg #l- 1的基础培养基中, 置于 35 e , 120 r #min- 1的摇床中培养. 每 3 ) 4d取 1ml菌液, 离心( 12 @ 1000r #min- 1)10min. 取上清液分别用于 HPLC Varian Prostar 210高效液相色谱仪及31P NMR Varian UNITY+ 500核磁共振仪检测. HPLC 条件[ 5, 6]: C18色谱柱 ( 150 @ 416mm ) ; 流动相为 20% 甲醇-80% 水; 流速 018ml#min- 1; 检测范围 210nm- 300nm, 检测波长为 215nm. 根据以下公式计算甲胺磷的降解率.降解率=S0- SnS 0@Cn- C0C0@ 100%式中, S0: 降解菌培养液中甲胺磷的起始浓度, Sn : 降解菌培养液培养 n 天时甲胺磷的浓度, C n:培养 n 天时对照组甲胺磷的浓度, C0: 对照组甲胺磷的起始浓度1第 24卷  第 1期2005 年   1 月环  境  化  学ENVIRONMENTAL CHEM ISTRYVol. 24, No. 1January  20052  结果与讨论211  甲胺磷降解率的测定  根据菌落外观以及采样地点的不同共挑取 14株菌落. 其中 1号采样点 4株, 2号 1株, 3号、4号和 5号采样点各 3株, 6号采样点盐度极高没有发现菌落. 测定 14株细菌在2周内对于甲胺磷的降解速率. 试验结果表明, 这 14 株甲胺磷降解细菌对于甲胺磷的降解效能都比较高, 在培养 4, 7,11, 14 d后, 对甲胺磷的平均降解率分别为 4217% , 6716% , 8111%和 8519%(表 1 ) .  由表 1可见, 在生化池一级及二级池混合污水( 3号)中分离出的菌株 C3b-H 的降解率最高, 一周的降解率为 74% , 两周后达到约 90% . 可见较高的农药压力, 驯化出了更高效的农药降解菌株.表 1 14 株细菌对甲胺磷的降解Table 1 degr adation r ate of 14 stains in 14 days菌株0d 4d 7d 11d 14d浓度(mg #l- 1)浓度( mg #l- 1)降解率( % )浓度( mg #l- 1)降解率( % )浓度( mg #l- 1)降解率( % )浓度( mg #l- 1)降解率( % )CON 49915 51717 52717 55910 56918C1c 44314 283 3814 15718 6613 8514 8218 6310 8715C1d 46512 29112 3916 16519 6612 10115 8015 7811 8513C 1Ê 49718 27718 4611 15614 7012 10312 8115 8811 8415C1- B 50515 30313 4211 18613 6511 12311 7812 8517 8511C2 49718 287 4414 17618 6614 11119 7919 99 8216C3 50610 30416 3918 18911 6416 9813 8216 7218 8714C3b-H 48011 26111 4715 13119 7410 7419 8610 5618 8916C3b-B 48011 291 4115 16519 6712 12615 7614 7218 8617C4 46114 30416 3612 16416 6612 11815 7710 9515 8118C4c 50312 28715 5511 17915 6612 10014 8211 7813 8614C4d 48114 30714 3815 16312 6719 10112 8112 7418 8614C5 49213 280 4511 16416 7118 9815 8211 7214 8711C5d 48011 28917 4118 16519 6712 9110 8311 6719 8716C 5Ê 49614 300 4117 17114 6713 10312 8114 8914 8412平均值 48511 29011 4217 16711 6716 10217 8111 7811 8519212  磷谱结果分析  对样品进行同步磷谱分析, 随着甲胺磷峰面积的减弱, 甲胺磷在 4216 ppm 处的峰也逐渐减弱,并向高场漂移, 在约24ppm , 10ppm 和1ppm 处出现新的峰. 不同菌株降解甲胺磷后产物磷谱峰不完全相同, 根据其产物的不同 14株菌株可分为 3种类型( A, B, C ) . 降解两周后的核磁结果见图 1.  在降解率相似的情况下, 属于 A组的菌株把甲胺磷的 P ) N, P ) O和 P ) S键都打断了, 使之完全降解为磷酸根, 而 B组降解菌虽然可以打断所有被降解甲胺磷分子的 P ) O 和 P ) S键, 但是还有部分分子的 P ) N 键尚未打断, C 组降解菌则只能打断所有被降解甲胺磷分子的 P ) O键, 大量分子的 P ) S 键, P ) N 键尚未被打断. 由于含有 P ) S, P ) N 键的化合物一般毒性较强, 因此, 在降解效能相差不大的情况下, A 组菌株的应用价值显然大于 B, C两组[ 1, 7, 8] .  具体产物如图 1所示. 这一结果同时证明所用细菌对甲胺磷浓度降低所起的作用不是简单的表面吸附作用, 而是不同程度地打断甲胺磷的 P ) N, P ) O 和 P ) S 键, 对其进行降解.3  小  结  在本实验中, 从长期受到甲胺磷污染的地区筛选出了 14 株具有甲胺磷耐受能力的细菌, 通过HPLC检测, 发现其对甲胺磷都具有较高的降解能力, 并且通过磷谱的同步检测发现, 这 14株降解42 环   境   化   学 24卷细菌虽然降解能力差别不大, 但是在相同时间内对甲胺磷分子的降解产物存在着区别, 其中 A 组菌株在降解过程中可以打断全部所降解甲胺磷分子的 P ) N, P ) O和 P ) S 键, 将其降解为无毒的磷酸根形式. 在实际应用中, 这类菌株的应用价值显然大于 B 组和 C组的菌株. 这一结果同时证明所用细菌对甲胺磷浓度降低所起的作用不是简单的表面吸附作用.图 1  甲胺磷经过三组细菌降解两周后的磷谱结果Fig1 1 31P NMR traced the MAP degraded results after 2 w eeks degr aded by 3 groups bacteria参  考  文  献[ 1 ]  范永仙, 陈小龙, 姜晓平等, 甲胺磷农药的生物降解研究进展, 微生物学杂志, 2002, 22 (3 )B45 ) 50[ 2 ]  陈茹玉, 刘纶祖, 有机磷农药化学 1上海: 上海科学技术出版社, 1995, 117 ) 120[ 3 ]  Schie P M, Young L Y , Isolat ion Characterizat ion of Ph eno-l Degrading Denit rif ying Bacteria, App l . E nv iron . M icrobiol1, 1998,64B 2432 ) 24338[ 4 ]  张兰英, 林学钰, 李慧芳等, 地下水中阿特拉津降解菌种的筛选及其降解实验, 环境化学, 2002, 21 ( 5 )B490 ) 493[ 5 ]  Henry K R, 张卓勇, 赵进英等, 环境水中甲基对硫磷、对硫磷和辛硫磷农药残留的 SPE-H PLC分析, 分析测试学报, 2002,( 5 )B50 ) 53[ 6 ]  刘新, 尤民生, 廖金英等, 甲胺磷降解细菌的分离以及降解活力的测定, 武夷科学, 2001, 17B1001 ) 4276[ 7 ]  David G Gorenstein, Phosphorus-31 NMR : Principles and Applicat ions, Orlando, Fla. : Academic Press, 1984[ 8 ]  江藤守总, 有机磷农药的有机化学与生物化学 1 北京: 化学工业出版社, 1981, 56 ) 5831P NMR AND HPLC TO SCREEN AND TRACE THE DEGRADATIONOF METHAMIDOPHOS (MAP )BY BACTERIAL U Yang1   NI Feng1   X U Peng-x iang1   WANG J ian-f eng1   H U Li-ming 1   ZH AO Yu-f en1, 2( 1  Department of Chemist ry and The Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province, College of Chemist ry and Chemical Engineering,Xiam en U niversity, Xiamen, 361005; 2  T he Key Laboratory for Bioorganic Phosphorus Chemist ry, M inist ry of Educat ion, Department ofChemistry School of Life Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing, 100084 )ABSTRACT  HPLC is the fastest and most accurate technique in the analysis of organic phosphorus pest icides ( OPPs) at present. HPLC showed that there w ere 14 st rains bacteria able to degrade the metham idophos ( MAP )and the highest degradat ion rate was 90% af ter 14 days . The results tracked by 31P NMR show ed that therew ere 3 st rains able to degrade MAP into phosphor acid through breaking all of the P ) N, P ) O and P ) Sbonds in 14 days. According ly , these st rains can be ut ilized to remove OPPs pollut ions.Keywords: metham idophos, degradat ion, HPLC, 31P NMR1 1期 路杨等: 31P NMR与 HPLC 联用筛选高效有机磷降解细菌 43 

~(31)P NMR与HPLC联用筛选高效有机磷降解细菌

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/56076/~%2831%29P_NMR%e4%b8%8eHPLC%e8%81%94%e7%94%a8%e7%ad%9b%e9%80%89%e9%ab%98%e6%95%88%e6%9c%89%e6%9c%ba%e7%a3%b7%e9%99%8d%e8%a7%a3%e7%bb%86%e8%8f%8c.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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