利用BALB/c小鼠子宫内膜异位症(EMs)模型,采用实时荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附试验,从mRNA水平和蛋白水平上检测了EMs BALB/c小鼠腹腔免疫细胞和腹腔液中的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在造模后变化情况.结果显示:造模后的21 d内MIF在基因水平和蛋白水平上都高于对照组,尤其在异位灶形成的早期阶段增加更为显著.提示MIF与EMs的发生发展过程关系密切,可能参与早期的病理活动过程

周卫东

张聪

石艳

许雅云

陈清西

陈琼华

Xiamen University Institutional Repository

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net第 49 卷 　第 2 期 厦门大学学报 (自然科学版) Vol. 49 　No. 2　2010 年 3 月 Journal of Xiamen University (Nat ural Science) Mar. 2010 　子宫内膜异位症小鼠巨噬细胞移动抑制因子变化规律的研究周卫东1 ,陈琼华2 3 ,许雅云2 ,张　聪1 ,石　艳1 ,陈清西1 3(1.厦门大学 生命科学学院 ,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 ,福建 厦门 361005 ;2. 福建医科大学附属厦门第一医院 ,福建 厦门 361004)　　收稿日期 :2009205215基金项目 :厦门市科技计划指导性项目(3502Z20077047 ;3502Z20084006)3 通讯作者 :chenqx @xmu. edu. cn ;cqhua616 @xmu. edu. cn摘要 :利用 BALB/ c 小鼠子宫内膜异位症 ( EMs)模型 ,采用实时荧光定量 PCR 技术和酶联免疫吸附试验 ,从 mRNA 水平和蛋白水平上检测了 EMs BALB/ c 小鼠腹腔免疫细胞和腹腔液中的巨噬细胞移动抑制因子 ( MIF) 在造模后变化情况. 结果显示 :造模后的 21 d 内 MIF 在基因水平和蛋白水平上都高于对照组 ,尤其在异位灶形成的早期阶段增加更为显著.提示 MIF 与 EMs 的发生发展过程关系密切 ,可能参与早期的病理活动过程.关键词 :子宫内膜异位症 ;巨噬细胞移动抑制因子 ;实时荧光定量 PCR ;酶联免疫吸附试验中图分类号 :R 711. 71 　　　　文献标识码 :A 　　　　　文章编号 :043820479 (2010) 0220272204　　子宫内膜异位症 ( EMs)是指子宫内膜出现于子宫腔以外的区域 (主要在盆腔腹膜) 所引起的一种病变.EMs 是最常见的妇科疾病之一 ,伴随着疼痛、不孕等症状 ,在育龄妇女中 ,其发病率大约为 10 % ,且还有上升的趋势[1 ] . EMs 的确切发病机制还不清楚 ,目前以Samp son 的“经血逆流种植学说”为主导 ,并认为 :一些有活性的子宫内膜组织碎片随经血逆流至腹腔 ,经历粘附 - 侵袭 - 血管形成的过程 ,逐渐形成具有分泌激素并对激素产生反应的活性病灶[2 ] . 巨噬细胞移动抑制因子 ( MIF) 是一种重要的免疫和促血管生成因子 ,文献报道 , EMs 患者腹腔液中 MIF 的水平显著高于正常妇女 ,提示 MIF 在 EMs 发病过程中发挥了重要作用[324 ] . 但是 ,在 EMs 发生发展过程中 MIF 发生怎样的变化 ,目前未见报道. 本研究构建 EMs 小鼠模型 ,分别运用实时荧光定量 PCR ( R T2PCR) 和酶联免疫吸附试验 ( EL ISA)检测 EMs 小鼠中 MIF 基因和蛋白水平 ,观察从子宫内膜到达盆腔至异位灶形成后的一段时间内 (21 d) EMs 小鼠腹腔微环境中 MIF 的变化情况 ,以期揭示 MIF 在 EMs 发病过程中可能存在的作用.1 　材料与方法1. 1 　动物、仪器与试剂SPF 级 BALB/ c 小鼠 175 只 ,雌性 ,8 周龄 ,体质量 19～21 g ,性周期 4～5 d ,厦门大学生命科学院实验动物中心提供. 在室温 21～23 ℃、湿度 60 %～75 %、12 h 光照交替的条件下喂养.仪器 : Roter2Gene3000 荧光定量 PCR 仪为澳大利亚 Corbett Research 公司产品 ;BIO2RAD My Cyler型普通 PCR 仪和 SIGMA 1214 离心机分别为美国BIO2RAD 和 SIGMA 产品. 试剂 : RNAspin Mini Kit购自瑞典 GE Healthcare 公司 ; R T2PCR 试剂盒购自日本 Ta KaRa 公司 ; EL ISA 试剂盒购自美国 R &DSystems 公司 ;其他试剂均为国产分析纯.1. 2 　动物分组及 EM 小鼠模型的建立挑选符合条件的 BALB/ c 小鼠 175 只 ,随机分成接受鼠 110 只为研究组 ,捐赠鼠 55 只 ,未造模组 10 只为对照组. 参照我们之前报道过的方法[ 5 ] 制作成 EMs小鼠模型. 设立 11 个观察日 (即造模手术后的第 1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,9 ,12 ,15 ,18 和 21 天) ,每次观察 10 只.1. 3 　样品收集颈椎脱臼法处死小鼠 ,腹腔注射 3 mL 无菌 PBS ,反复冲洗小鼠腹膜腔辅予轻揉腹部 20 次 ,尽可能吸尽腹腔洗液置于 2 个 PE 管中 , 1 个管离心 10 000 r/min ,1 min ,弃上清液 ,收集沉淀细胞 ,并迅速放入液氮罐中 ,用于提取 RNA ; 另 1 管离心 2 000 r/ min , 5min ,收集上清液 ,迅速放入液氮罐中 ,用于酶联免疫吸附试验.1. 4 　总 RNA 提取及 RT2PCR© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net总 RNA 的提取 :采用 RNAspin Mini 试剂盒提取 ,操作按照说明书进行. cDNA 合成 :按 R T2PCR 试剂盒说明书配制 R T2PCR 反应体系 20μL ,含 4μLPrimeScript Buffer ( 5 ×) , 1. 0 μL PrimeScrip t R TEnzyme Mix Ⅰ,1. 0μL Oligo d T Primer (50μmol/L ) ,1. 0μL Random 6 mers (100μmol/ L) ,10μL To2tal RNA ,3μL dd H2 O. 反转录反应条件为 : 37 ℃ 15min (反转录反应) ;85 ℃5 s (反转录酶的失活反应) .R T2PCR :按 R T2PCR 试剂盒说明书进行. 引物序列由宝生物工程大连有限公司合成 ,以β2actin 为内参.β2actin 上游引物序列 : 5′2CA TCCGTAAA GACCTC2TA T GCCAAC23′; 下游引物序列 : 5′2A T GGA GC2CACCGA TCCACA23′. MIF 上游引物序列 : 5′CT G2CACA GCA TCGGCAA GA23′;下游引物序列 : 5′2T T2GGCA GCGT TCA T GTCGTAA23′. 20 μL 体系中含10μL SYBR Premix EX Taq (2 ×) ,0. 4μL PCR For2ward Primer (10μmol/ L) ,0. 4μL PCR Reverse Prim2er (10μmol/ L) ,1. 6μL cDNA 和 7. 6μL dd H2 O. 反应条件为 :95 ℃预变性 10 s ,1 个循环 ;95 ℃5 s ,60 ℃20 s , 45 个循环. 反应在 Roter2Gene3000 荧光定量PCR 仪上进行. R T2PCR 产物利用仪器上自带的 R G23000 系统软件分析 ,可观察扩增曲线和熔解曲线 ,并对 cDNA 的含量进行定量分析 ,计算样本的 △△CT值. 通过 2 - △△CT 方法[6 ] 分析 MIF 基因的相对表达情况.1. 5 　EL ISA腹腔液 MIF 的蛋白定量用 EL ISA 测定 ,具体操作按照试剂盒 (Mouse MIF EL ISA kit)说明进行.1. 6 　统计分析采用 SPSS 14. 0 软件进行统计分析 ,数据以 x ±s表示 ,两组间比较采用两样本 t 检验 ,相关性分析采用person 相关分析 ,以 p < 0. 05 为差异有统计学意义.2 　实验结果2. 1 　造模结果造模后于第 l ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,9 ,12 ,15 ,18 ,21 天观察每次剖腹 10 只接受鼠 ,了解造模结果. 第 1 天见异位灶生长 ,第 2 天开始出现鲜红色斑点或血泡 ,此后病灶的颜色和大小也随着时间发生变化 ,逐渐变为白色或透亮的囊肿或疤痕. 取下病损组织 ,用常规石蜡包埋、H E 染色 ,根据 EMs 的病理学诊断标准 ,镜下可见子宫内膜腺体或间质者可确诊为子宫内膜异位症. 图 1、2 显示的分别是 EMs 小鼠模型和异位灶病理组织切片图. 在 110 只接受鼠中 ,有 101 只造模成功 ,成功率为 91. 82 % ,造模效果良好.2. 2 　不同造模时间内 EMs 小鼠模型 MIF mR2NA 的变化情况用 R T2PCR 检测 120 只 BALB/ c 小鼠 (其中未造模组 10 只为对照组) 腹膜腔中免疫细胞 MIF mRNA的水平 ,观察在造模后不同观察日内 MIF mRNA 表达的变化情况 (图 3) ,并将对照组规定为第 0 天. 结果显示 ,造模后 MIF mRNA 的水平在 11 个观察日里均显著高于未造模组且呈现出一定的变化规律. 第 1 天开始上升 ,至第 2 天达到第 1 个峰值 ,而后至第 5 天回落到一低值 ;在第 6 天和第 12 天分别又出现 2 个峰值 ,在其他时间里则在一定水平上波动. 第 1 个峰值(3. 64 ±0. 21)又明显比第 2 个峰值 (1. 88 ±0. 15)和第3 个峰值 (1. 88 ±0. 11)要高 ( p < 0. 01) ;而第 2 个峰值和第 3 个峰值之间无显著性差异 ( p > 0. 05) ;造模后第 1～3 天的均值 (2. 70 ±0. 83) 显著高于第 4～21 天的均值 (1. 54 ±0. 23) ( p < 0. 05) ;第 4～21 天的均值亦显著高于对照组 (1. 00 ±0. 09) ( p < 0. 05) .·372·第 2 期 　　　　　　　　　　周卫东等 :子宫内膜异位症小鼠巨噬细胞移动抑制因子变化规律的研究© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net　图 3 　MIF mRNA 水平随时间的变化情况　Fig. 3 　Change in mRNA level of MIF over time2. 3 　不同造模时间内 EMs 小鼠模型 MIF 浓度的变化情况从图 4 可以看出 ,造模后 MIF 的浓度在 11 个观察日里均显著高于未造模组且呈现出一定的变化规律.从造模第 1 天起小鼠腹腔液中 MIF 的浓度随即开始上升 ,并于第 3 天达到最高峰 ,并于第 5 天回落至低值 ;第12 天再次出现一个峰值 ,而后又下降并在一定水平内波动. 第 1 个峰值 [ (1. 109 ±0. 061) ng/ mL ]又显著高于第 2 个峰值[ (0. 774 ±0. 046) ng/ mL ] ( p < 0. 05) . 造模后第 1～4 天的均值 [ (0. 983 ±0. 105) ng/ mL ]显著高于第 5～21 天的均值[ (0. 629 ±0. 081) ng/ mL ] ( p <0. 05) ;第 5～21天的均值显著高于对照组[ (0. 38 ±0. 02) ng/ mL ] ( p < 0. 05) .　图 4 　MIF 蛋白水平随时间的变化情况　Fig. 4 　Change in the protein level of MIF over time3 　讨　论EMs 是一种受多种因素影响的疾病 ,其发病机制还尚不清楚. 越来越多的证据表明炎症反应与 EMs 有着密切的联系. 研究发现 ,与健康妇女相比 EMs 患者腹腔内巨噬细胞的数目和活性增加 ,其分泌的一些炎症相关因子如 IL21β, IL26 , IL28 , TN F2α, MCP21 ,MMP29 等也有明显的上升[ 7 ] . 因此 ,另一炎症相关因子 MIF 与 EMs 有着何种联系 ,值得我们研究. 尽管已有报道 EMs 患者腹腔液 MIF 水平显著高于正常人 ,但 MIF 的上升是发生在异位病灶形成之前还是形成之后以及它的变化是否遵循着某种模式均尚不清楚.MIF 于 1966 年首次被报道 ,是最早发现的细胞因子之一[8 ] . 近年来 ,人们发现 MIF 是一种重要的多功能细胞因子 ,参与了炎症反应、免疫应答、细胞增殖、血管生成以及肿瘤形成等多种生理生化过程 ,与多种炎症疾病和自身免疫疾病的发病有关[9210 ] . Yang 等[11 ]研究发现 ,人的子宫内膜异位细胞能够分泌 MIF ,并具有促进人内皮细胞有丝分裂作用 ,可能与 EMs 中新生血管形成过程有关. Kat s 等[12 ] 采用 R T2PCR 和Western Blot 技术 ,发现 EMs 患者的异位组织中 ,MIF 在基因和蛋白水平上都高效表达 ,尤其是在有明显血管形成和白细胞浸润的异位灶中 ,MIF 的高表达更为明显 ;另外 MIF 在异位组织中的高效表达主要是在间质中的内皮细胞、巨噬细胞和 T 淋巴细胞 ,暗示MIF 与血管形成和炎症局部浸润有着紧密联系.本研究发现 ,MIF 在造模后的 21 d 内在基因水平和蛋白水平上都高于对照组 ,其中异位灶形成的早期阶段 (第 1～3 天) ,MIF mRNA 的均值为 (2. 70 ±0. 83)显著高于中晚期 (第 4～21 天) 的均值 (1. 54 ±0. 23) ,后者又显著高于对照组 (1. 00 ±0. 09) ;异位灶形成的早期阶段 (第 1～4 天) MIF 的蛋白浓度均值[ (0. 983 ±0. 105) ng/ mL ]显著高于中晚期 (第 5～21 天) 的均值[ (0. 629 ±0. 081) ng/ mL ] ,后者又显著高于对照组[ (0. 38 ±0. 02) ng/ mL ] . 可见 ,不管是在基因水平还是在蛋白水平上 ,MIF 在异位灶形成的早期阶段都出现了高表达的情况. Kat s 等[ 12 ] 曾发现 MIF 在红色细小的异位灶中的表达显著高于在典型的蓝黑色或者白色异位灶中的表达 ,提示 MIF 主要在具有活性及早期阶段的异位灶中表达 ,支持了我们的研究结果. 从MIF 在异位灶形成早期的高表达及 MIF 参与促炎反应及血管形成的生理效应上 ,有理由推测 MIF 在EMs 早期病灶产生和新生血管形成中起着重要作用.此外 ,我们的研究还发现 MIF 在造模后的第 1 天便显著上升 ,而此时尚未有异位灶形成. 也就是说 MIF 在异位灶形成之前就开始上升 ,这和我们之前研究的几种细胞因子的变化规律是一致的[5 ] . 提示 MIF 的增加很有可能是 EMs 形成的原因之一 ,而不是由 EMs 引起的结果 ,这还需要进一步研究证实.·472· 厦门大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2010 年© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net在 11 个观察日里 ,MIF 的蛋白水平与 mRNA 水平较为一致. 提示 EMs 小鼠模型中后期阶段 MIF 分泌的减少 ,更有可能是由于 mRNA 合成减少或者mRNA 的不稳定性而引起的 ,在翻译水平或者翻译后的事件引起的可能性较小. 因此 ,在 EMs 中 MIF 在转录水平上如何调节 ,有必要进一步深入研究.综上所述 ,本研究显示在 EMs 小鼠造模后的一段时间内 ,MIF 水平变化遵循着某种较为固定的模式 ,其基因和蛋白水平在异位病灶形成前就显著上升 ,并在早期阶段 (第 1～4 天)维持一高水平 ,中晚期 (第 5～21 天) 明显下降 ,但仍显著高于正常小鼠. 提示 MIF的增加更可能是 EMs 形成的原因而不只是 EMs 引起的结果 ,它可能在异位内膜早期的血管形成过程中发挥重要的作用 ,从而作为 EMs 病理生理过程中一种关键的细胞调节因子 ,值得我们进行更深入的研究.参考文献 :[1 ] 　Giudice L C , Kao L C. Endometriosis [J ] . Lancet , 2004 ,364 (9447) :178921799.[ 2 ] 　Annemiek W N ,Patrick G G ,Ayse Y D ,et al. Pathogene2sis of endometriosis[J ] . Best Practice & Research ClinicalObstet rics and Gynaecology ,2004 ,18 (2) :2332244.[3 ] 　Metz C N ,Bucala R. Role of macrophage migration inhib2itory factor in the regulation of the immune response[J ] .Adv Immunol ,1997 ,66 :1972223.[4 ] 　Kat R , Collette T , Metz C N ,et al. Marked elevation ofmacrophage migration inhibitory factor in the peritonealfluid of women with endometriosis[J ] . Fertil Steril ,2002 ,78 (1) :69276.[ 5 ] 　Chen Q H ,Zhou W D ,Su Z Y ,et al. Change of proinflam2matory cytokines follows certain patterns after inductionof endometriosis in a mouse model [J / OL ] . Fertil Steril ,(2009204201) [ 2009205215 ] http :/ / www. scienced : rect .com/ science. 2009. 02. 013.[6 ] 　Livak K J ,Schmittgen T D. Analysis of relative gene ex2pression data using real2time quantitative PCR andthe2 - △△CT method[J ] . Methods ,2001 ,25 (4) :4022408.[7 ] 　Harada T ,Iwabe T , Terakawa N. Role of cytokines in en2dometriosis[J ] . Fertility and Sterility ,2001 ,76 :1210.[8 ] 　David J R. Delayed hypersensitivity in vit ro :it s mediationby cell2f ree substances formed by lymphoid cell2antigeninteraction[J ] . Pathology ,1966 ,56 :72277.[9 ] 　Nishihira J , Ishibashi T , Fukushima T ,et al. Macrophagemigration inhibitory factor ( MIF) : it s potential role intumor growth and tumor2associated angiogenesis[J ] . AnnN Y Acad Sci ,2003 ,995 :1712182.[10 ] 　Calandra T , Roger T. Macrophage migration inhibitoryfactor : a regulator of innate immunity[J ] . Nat Rev Im2munol ,2003 ,3 :7912800.[11 ] 　Yang Y ,Degranpre P , Kharfi A ,et al. Identification ofmacrophage migration inhibitory factor as a potent en2dothelial cell growth2promoting agent released by ectop2ic human endometrial cells[J ] . J Clin Endocrinol Metab ,2000 ,85 :472124727.[12 ] 　Kats R ,Metz C N ,Akoum A. Macrophage migration in2hibitory factor is markedly expressed in active and early2stage endometriotic lesions [ J ] . J Clin EndocrinolMetab ,2002 ,87 (2) :8832889.Change of MIF after Induction of Endometriosis in a Mouse ModelZHOU Wei2dong1 ,C H EN Qiong2hua2 3 ,XU Ya2yun2 ,ZHAN G Cong1 ,S HI Yan1 ,C H EN Qing2xi1 3(1. Key Laboratory of the Minist ry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering ,School of Life Sciences ,Xiamen University ,Xiamen 361005 ,China ;2. The First Hospital of Xiamen Attached to the Fujian Medical University ,Xiamen 361004 ,China)Abstract :By using the built BALB/ c mice endometriosis model ,the mRNA and protein levels of MIF in the peritoneal cavity immu2nocytes and peritoneal fluid of model mice were detected through real2time quantitative RT2PCR and EL ISA ,respectively. The result sshowed that in the 21 days after induction the mRNA and protein levels of MIF in model mice were all significantly higher than con2t rol group . MIF was markedly expressed in early2stage endometriotic lesions. It was revealed that MIF play a key role in the patho2physiology of endometriosis ,and may involve in the early process of the pathology.Key words :endometriosis ;MIF ;real2time quantitative PCR ; EL ISA·572·第 2 期 　　　　　　　　　　周卫东等 :子宫内膜异位症小鼠巨噬细胞移动抑制因子变化规律的研究

子宫内膜异位症小鼠巨噬细胞移动抑制因子变化规律的研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/19815/%e5%ad%90%e5%ae%ab%e5%86%85%e8%86%9c%e5%bc%82%e4%bd%8d%e7%97%87%e5%b0%8f%e9%bc%a0%e5%b7%a8%e5%99%ac%e7%bb%86%e8%83%9e%e7%a7%bb%e5%8a%a8%e6%8a%91%e5%88%b6%e5%9b%a0%e5%ad%90%e5%8f%98%e5%8c%96%e8%a7%84%e5%be%8b%e7%9a%84%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

子宫内膜异位症小鼠巨噬细胞移动抑制因子变化规律的研究

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Xiamen University Institutional Repository