应用双向电泳技术研究比较两种不同品质水稻(佳辐占和广陆矮4号)叶片的蛋白质组分的差异.两种水稻叶片提取的蛋白质的双向电泳图谱斑点清晰,形态规则.采用考马斯亮蓝染色获得约400个斑点,银染图谱约800个斑点.两种水稻的蛋白质图谱考马斯亮蓝染色图谱存在5个显著差异点,银染图谱存在11个显著差异点

林建峰

石艳

陈清西

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第 43 卷 　增 　刊2004 年 8 月厦门大学学报 (自然科学版)Journal of Xiamen University (Natural Science)Vol. 43 　Sup.Aug. 2004文章编号 :043820479 (2004) S2040204佳辐占和广陆矮 4 号水稻叶片蛋白质的双 向 电 泳 比 较 研 究收稿日期 :2003210220基金项目 :厦门大学预研基金和教育部跨世纪人才经费资助作者简介 :林建峰 (1981 - ) ,男 ,硕士研究生.3 Corresponding author , Tel/ Fax :0592 - 2185487 ,　E2mail :chenqx @jingxian. xmu. edu. cn林建峰 ,石　艳 ,陈清西 3(厦门大学生命科学学院 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 ,福建 厦门 361005)摘要 : 应用双向电泳技术研究比较两种不同品质水稻 (佳辐占和广陆矮 4 号) 叶片的蛋白质组分的差异. 两种水稻叶片提取的蛋白质的双向电泳图谱斑点清晰 ,形态规则. 采用考马斯亮蓝染色获得约 400 个斑点 ,银染图谱约 800 个斑点. 两种水稻的蛋白质图谱考马斯亮蓝染色图谱存在 5 个显著差异点 ,银染图谱存在 11 个显著差异点.关键词 : 水稻 ;品质差异 ;双向电泳中图分类号 : Q 946 文献标识码 :A 　　　　　　　　　　　　　　　　　水稻是世界上最重要的粮食作物之一. 随着人民生活水平的提高和稻作生产的发展 ,稻米品质问题开始受到重视 ,已成为水稻育种的一个十分重要的育种目标. 过去几十年国内外稻米品质研究大体为 4 个方面 :稻米品质的测定与评价、性状的遗传研究及育种实践、性状生理生化及生态方面研究、加工方法及储存条件对稻米品质的影响[1 ] ,而对品质形成的机理研究甚少. 已有报道米质的形成与多种酶有关 ,其中与淀粉合成的酶系关系较为密切[2～4 ] .但是这些酶活性变化的原因何在 ,酶活性变化究竟对稻米品质形成有何影响 ,目前还没有相关的报道.虽然能够通过基因工程的方法缩短优质米育种时间 ,但是因为稻米品质性状是个综合性状 ,其遗传组成较为复杂 ,既受主基因作用 ,又受微效基因影响[5 ] ,通过改变稻米遗传性状的基因工程育种方法带有随机性和盲目性. 如果对这些遗传性状的产物即执行者蛋白质有充分了解 ,揭示这些蛋白质影响稻米品质的规律 ,有望为育种提供新方向. 本文应用双向电泳技术 ,研究比较不同品质水稻叶片蛋白质组分的差异. 为下一步工作即通过蛋白质组学手段筛选出真正影响稻米品质的蛋白质或酶 ,并通过对这些蛋白质的研究揭示这些蛋白质影响稻米品质的规律提供必要的研究基础.1 　材料与方法1 . 1 　材 　料广陆矮 4 号和佳辐占新鲜叶 (水稻栽培时间 50d ,距插秧时间 15 d) 由厦门大学生命科学学院水稻育种专家王候聪教授提供. 其中广陆矮 4 号是广东省农科院水稻研究所培育的早籼稻品种 ,其稻米长宽比 2. 4 ,垩白度 100 % ,垩白率 100 % ,直链淀粉含量 26 % ,属 4 级米 ;佳辐占是厦门大学生命科学学院水稻育种组培育的早籼稻品种 ,其稻米长宽比3. 7 ,垩白度 0. 1 % , 垩白率 2 % , 直链淀粉含量16 % ,品质基本符合农业部部颁一级优质稻米标准.1 . 2 　样品处理参照文献[ 6 ]方法. 取新鲜水稻叶片各 1 g ,加入100 mgPVP 及少许石英砂于研钵中液氮研磨成粉末. 加入 15 mL 10 %三氯乙酸丙酮液 (内含 0. 07 %β2巯基乙醇) ,于 - 20 ℃放置 1. 5 h. 离心 (15 000 r/min ,4 ℃) 15 min ,弃上清. 沉淀用冷丙酮 (含0. 07 %β2巯基乙醇)冲洗后再悬浮于该溶液中 , - 20 ℃放置1h. 离心 (15 000 r/ min ,4 ℃) 15 min. 重复以上步骤3 次. 沉淀抽真空干燥 2 h ,样品制成丙酮干粉. 每毫克干粉加 8μL 裂解缓冲液 (含 8 mol/ L 尿素 ,4 %TritonX2100 ,5 % ME ,2. 5 % p H 3. 5～10 的两性电解质载体) , 30 ℃处理 1h. 离心 (15 000 r/ min) 15min. 取上清液再次离心 5 min ,用于双向电泳分析或 - 80 ℃冰冻保存.1 . 3 　样品蛋白质浓度测定采用 Bradford 考马斯亮蓝法[7 ]测定所制备的蛋白质样品浓度.1 . 4 　蛋白组学的双向电泳第 1 向为等电聚焦电泳 ( IEF) ,第 2 向为 SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS2PA GE) . IEF 采用管状 ,玻璃管长度为 20 cm ,内径为 2 mm. 凝胶配制参照文献[ 8 ] ,并加以改良. 取 2. 06 g 尿素 ,750μL 双蒸水 ,750μL 10 % TritonX2100 ,500μL 30 %凝胶储液(28. 38 % Acr21. 62 % bis) ,30 ℃水浴使尿素充分溶解后加入 250μL 两性电解质载体 ,真空抽气 10 min后加入 2μL TEMED 和 8μL10 % APS. 混匀后立即灌胶 ,胶长 15. 5 cm. 在灌好的胶管顶部覆盖 1 cm高的正丁醇. 垂直放置 ,室温下聚合 1. 5 h 以上. 待胶聚合后倒去上层正丁醇 ,用双蒸水洗 1～2 次. 每管上样 100μL ,并在其上加 30μL 覆盖液 (8 mol/ L尿素 ,5 % TritonX2100 ,1. 5 %两性电解质载体 ,5 %β2巯基乙醇) ,再加 20 mmol/ L NaOH 至管口. 电泳液上槽为 20 mmol/ L NaOH ,接负极 ,下槽为 10mmol/ L H3 PO4 ,接正极. 按 300 V215 min ,400 V220min ,500 V230 min ,600 V230min ,700 V216 h 的程序电泳聚焦. 第 2 向 SDS2PA GE 采用板状 ,玻璃板规格为 20 cm ×20 cm. 分离胶浓度为 12 % ,浓缩胶浓度为 5 %. 灌胶后正丁醇封胶 1 cm 高. 待聚合 ,倒去正丁醇并清洗胶面. 微波炉加热固胶液 (平衡液配置的 1 %琼脂糖) ,融化后加在浓缩胶上形成一薄层. 把平衡好的一向胶条平放于固胶液上 ,再在其上加固胶液以固定胶条. 小心除去胶下气泡. 于胶两端各加 5 μL 电泳指示剂 ( 0. 2 %溴酚蓝 , 20 %甲醇 ,20 %甘油 ) , 于上下槽加入二向电泳缓冲液 ( 25mmol/ L Tris ,192 mmol/ L 甘氨酸 ,0. 1 % SDS) ,恒流 25 mA/ 块 ,4 ℃,待溴酚蓝指示剂至距胶尾缘 1cm 处时结束电泳. 电泳仪为北京六一仪器厂生产的D YY24 型稳压稳流电泳仪.1 . 5 　染色及扫描电泳胶板采用考马斯亮蓝和银染两种方法染色. 考马斯亮蓝染色液用双蒸水配制 ,内含 0. 05 %R2250、50 %甲醇和 10 %乙酸中 ,摇床上振荡染色1. 5 h. 7 %醋酸脱色. 银染方法参考文献[ 9 ] . 银染 40min ,显色 20 min ,终止液终止 10 min ,蒸馏水洗 3次 ,5 min/ 次 ;胶浸泡于 10 %甘油液中保存. 胶片用Powerlook III 扫描仪 (UMAX)进行胶片扫描.1 . 6 　图谱分析采用人工及应用软件 Genomic solutions Investi2gator HT Analyzer (Version 2. 02) 分析所得双向电泳图谱.2 　结果与讨论经测定广陆矮 4 号样品浓度为 2. 8 mg/ mL ,佳辐占样品浓度为 3. 0 mg/ mL ,各取 100μL 佳辐占和广陆矮 4 号样品在同等条件下进行叶片全蛋白质双向电泳 ,经考马斯亮蓝染色后获得双向电泳图谱 ,结果 (见图 1)显示 400 多个蛋白质斑点. 斑点清晰 ,形态规则 ,且基本无横向和竖向条纹及拖尾现象.全蛋白组的双向电泳银染结果见图 2. 银染图谱大约有 800 个斑点. 结果表明电泳图谱的银染方法较考马斯亮兰染色法的灵敏度高 ,可以显示蛋白质含量较低的斑点.利用人工及应用软件比较不同品质水稻的双向电泳图谱找到了一些蛋白点差异 (见图 3、4) . 其中 ,在考马斯亮蓝染色图谱 (图 3) 中 ,找到 5 个差异点(图中的 A、B、C、D 和 E 所显示) ,即在佳辐占的图谱中存在广陆矮 4 号所没有的 A、B 和 D 点 ,却不存在广陆矮 4 号所具有的 C 和 E 点 ;在银染色图谱(图 4)中 ,找到 11 个差异点 (图中的 A2K 点所示) .因为两种染色方法的分辨率不同 ,后者有着较高的分别率 ,所以两者显示的差异点数目不同 ,后者显示的差异点较多.水稻叶片全蛋白质双向电泳方法国内外已有多篇文献报道 ,因此从样品处理到双向电泳的方法都较为成熟. 但是本文的着重点在于比较品质差异很大两种水稻品种 (佳辐占和广陆矮 4 号)的蛋白质种类和含量的差别 ,因此 ,我们选择具有高通量和高分别率的双向电泳方法进行分析比较. 通过比较考马斯亮蓝染色图谱找到 5 个差异点 ,但是对于含量较低的蛋白质则无法比较. 因此进一步通过银染获得银染图谱 ,比较后找到 11 个差异点. 如果直接通过银染得到双向电泳图谱 ,含量较大的蛋白质斑点则可能因为量太大重叠而无法分辨. 通过比较两种染色图谱的差异点发现考马斯亮蓝染色图谱的一个差异点 (图 3a 中的 B 点)没有在银染图谱差异点中 ,进一步比较图谱发现原来此差异点在考马斯亮蓝染色图谱与另一蛋白质有所重叠 ,类似此蛋白质的拖尾 ,·14·增 　刊 　　　　　　　　　林建峰等 :佳辐占和广陆矮 4 号水稻叶片蛋白质的双向电泳比较研究因此误以为是差异点. 但在银染图谱中则很明显是两个蛋白质 ,则该点未算为差异点. 因此应用考马斯亮兰2银染复合染色法 ,不仅有效地把考马斯亮蓝染色和银染色的优点结合起来 ,提高蛋白质凝胶电泳的分辨率 ,还能进一步验证是否存在差异点. 这样既可对样品中主要蛋白质进行分析 ,又可对样品中微量蛋白质组分作进一步分析. 特别适合于组份间含量差异悬殊的复杂水稻叶片全蛋白质样品的分析比较.通过双向电泳图谱比较获得的这些差异点 ,这些差异蛋白质中的某些蛋白是否与两种水稻品质的形成有关 ,还有待进一步实验探讨. 本文为下续的工作即通过蛋白质组学手段筛选出真正影响稻米品质的蛋白质或酶 ,并通过对这些蛋白质或酶的研究揭示这些蛋白质影响稻米品质的规律提供必要的研究基础.参考文献 :[1 ] 　黄发松 ,罗玉坤 ,庞乾林. 我国优质稻米的生产现状和发展对象[J ] . 中国稻米 ,1998 , (6) :3 - 6.[2 ] 　Nakamura Y , Yuki K. 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Electrophoresis ,1987 , (8) :93 - 99.Comparative Studies on the Leaf Proteins of Jiafuzhan Rice andGuanluai (4 # ) Rice by Two2dimensional ElectrophonesisL IN Jian2feng ,SHI Yan ,CHEN Qing2xi 3( The Key Lab of Education Minist ry for Cell Biology and Tumor Cell Engineering ,School of Life Sciences ,Xiamen University ,Xiamen 361005 ,China)Abstract : Two2dimensional electrophonesis (2D2PA GE) was used to study the different compositions betweenrice species of J iafuzhan and Guanluai 4 # . The spots in the 2D2PA GE were clear and inerratic. There wereabout 400 spots and 800 spots detected by Coomassie Brilliant Blue2stained and by silver2stained respectively.There were five different spots between two species of rice in Coomassie Brillian Blue2stained gel and eleven dif2ferent spots between two species of rice in silver2stained gel.Key words : Rice ; different quality ; two2dimensional electrophoreses图版说明图 1 　水稻叶片全蛋白质双向电泳考马斯亮蓝染色图谱 (1a :佳辐占 ;1b :广陆矮 4 号)图 2 　水稻叶片全蛋白质双向电泳双向电泳银染色图谱 (2a :佳辐占 ;2b :广陆矮 4 号)图 3 　佳辐占与广陆矮 4 号叶片全蛋白质双向电泳考马斯亮蓝染色图谱差异比较图. a、c 为佳辐占 ;b、d 为广陆矮 4 号 ; A、B、C、D、E为差异点图 4 　佳辐占与广陆矮 4 号叶片全蛋白质双向电泳银染图谱差异比较图. a、c 为佳辐占 ;b、d 为广陆矮 4 号 ; A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 和 K为差异点·24· 厦门大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　 　　　　　　　　2004 年·34·增 　刊 　　　　　　　　　林建峰等 :佳辐占和广陆矮 4 号水稻叶片蛋白质的双向电泳比较研究

佳辐占和广陆矮4号水稻叶片蛋白质的双向电泳比较研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/19911/%e4%bd%b3%e8%be%90%e5%8d%a0%e5%92%8c%e5%b9%bf%e9%99%86%e7%9f%ae4%e5%8f%b7%e6%b0%b4%e7%a8%bb%e5%8f%b6%e7%89%87%e8%9b%8b%e7%99%bd%e8%b4%a8%e7%9a%84%e5%8f%8c%e5%90%91%e7%94%b5%e6%b3%b3%e6%af%94%e8%be%83%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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