作者利用 Balb/ c小鼠的血管紧张素  的 1型受体 (AT1 )基因和兔 AT1 基因的序列的不同 ,合成了一个新的含有两种动物序列的内标准 RNA,有效地消除了二级结构对反转录 PCR(RT- PCR)的影响。本研究对利用这种内标准 RNA进行定量 RT- PCR进行初步评价

万发银

夏宁邵

张军

曾定

汪家瑞

陈福

Xiamen University Institutional Repository

定量反转录 PCR 检测血管紧张素Ⅱ的1型受体内标准的构建X万发银1* * , 汪家瑞1, 夏宁邵2 ,张　军2 ,曾　定2 ,陈　福3( 1. 首都医科大学宣武医院心内科,北京 100053; 2. 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室; 3.厦门大学抗癌中心)摘要: 作者利用 Balb/ c小鼠的血管紧张素Ⅱ的1型受体( AT 1)基因和兔 AT 1基因的序列的不同,合成了一个新的含有两种动物序列的内标准 RNA, 有效地消除了二级结构对反转录 PCR( RT -PCR )的影响。本研究对利用这种内标准 RNA 进行定量 RT-PCR 进行初步评价。关键词: 受体,血管紧张素; 定量 RT -PCR ;标准曲线中图分类号: Q52　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1005- 3271( 2000) 06-0432-03Synthesis of internal standard for detecting expression of angiotensin Ⅱtype 1 receptor by quantitative reverse transcription polymerase chainreactionWAN Fa-y in,WA NG J ia-r ui , X IA N ing-shao, ZH AN G Jun, ZEN G Ding, CH EN FuDepartment of Cardiolog y, Xuanwu Hospital , Capital M edical Univ ersity, Beijing 100053, ChinaAbstract: In this test , w e synthesized an internal standard RNA, w hich have part sequences ofreceptor type 1 o f ATⅡ ( A T 1 ) gene of the Balb/ c mouse and rabbits, ut ilizing dif ference of theAT 1 gene sequence in these tw o animals, T his inter nal standar d RN A abolishes the inf luence ofthe secondary st ruture in the reverse transcript ion polymerase chain react ion ( RT -PCR) . In thestandard curv e est imation by the quant itat ive RT -PR using this internal standard RN A, theco rrelation coef f icient is 0. 998. From above data, it is suggested that the AT 1 expressiondetect ing by quant itat ive RT -PCR using this internal standard RNA can be truly r ef lected and thequant itat ive RT-PCR using this internal standard RNA is a credible method. M oreover, thisinternal standard RNA can be made simply and speedily .Keyword: receptors, ang iotensin; quant itat ive r ev erse t ranscript ion polymerase chain react ion;standard curve est imation　　血管紧张素Ⅱ受体的1型受体( ang iotensin Ⅱtype 1 receptor , AT 1)作为肾素-血管紧张素系统的重要组成成分及心血管系统作用的重要执行者,近年来越来越受到重视。目前的研究表明, AT 1可以导致心肌和血管平滑肌的肥大 [ 1, 2] , 影响心血管系统组织中一些细胞因子的含量[ 3],并参与冠状动脉粥样硬化的形成[ 4] 及心肌梗死后的心室重构 [ 5]。应用AT 1拮抗剂可以减轻血管紧张素Ⅱ的影响并改善患者的血流动力学, 从而进一步影响患者的预后。但目前对 A T 1的研究主要是通过应用 AT 1受体拮抗剂而得到的结果, 对 AT 1受体的表达方面的研究较少,其原因主要是对 AT 1表达定量方法存在困难。1　材料和方法1. 1　内参 RNA 的合成1. 1. 1　取 Balb/ c 小鼠一只处死后取1 g 肝脏组织提取基因组DNA。在0. 5 ml Eppendo rf管中加入10×不含Mg2+的 T aq DNA 聚合酶缓冲液10 Ll,上游引物 F1( ATCAT CT T TGTGGTGGGAA )和下游引物 R1( T CAGAAGAACAAGCCAAGAAA )各50pmo l/ L , 25 mmol/ L 的 MgCl26 Ll , 10 mmol/ L 的dNTP 混合物2 Ll , Taq DNA 聚合酶5 U ,提取的基因组 DNA 0. 2 Ll,补双蒸水至100 Ll。按以下程序进行扩增; 94℃ 7 m in 预变性; 94℃ 40 s, 56℃ 40 s,·432· 心 脏 杂 志 ( Chin Hear t J) 2000, 12( 6)X 本实验获得厦门大学肿瘤细胞工程实验室开放基金的资助。* * 现在厦门市174医院内二科　36100372℃ 50 s 循环35次; 72℃7 m in 延伸。将扩增的片段回收后插入 pGEM-T 载体后用ApaⅠ和EcoRⅠ进行酶切,去除片段,回收载体。1. 1. 2　取兔肝脏组织一块应用 Tr izol RNA 提取试剂提取兔肝总 RNA ,在0. 5 m l Eppendor f管中加入总 RNA 样品3 Ll, DEPC 水5 Ll,下游引物 R1 20pmol混匀放入70℃变性10 min。取出后冰浴5 m in,并加入5×AMV 反转录酶缓冲液4 Ll, 10 mmol / L的 dNTP 0. 5 Ll, RNAsin 1 U , AMV 反转录酶2 U,用 DEPC 水补至20 Ll后混匀并稍加离心。42℃温育1 h。94℃加热2 min。在0. 5 m l Eppendor f管中加入10×不含Mg2+的 T aq DNA 聚合酶缓冲液10 Ll,上游 引 物 F1 和 下 游 引 物 R2( CGGAA TT CGT AGAGGTT GAAACTGA ) 各 50pmol/ L , 25 mmol / L 的 MgCl2 6 Ll, 10 mmol/ L 的dNT P 混合物2 Ll, T aq DNA 聚合酶5 U ,反转录产物1 Ll,补双蒸水至100 Ll, 按与上述( 1. 1. 1)相同的程序进行扩增。将扩增的片段回收后插入 pGEM-T载体后用ApaⅠ和EcoRⅠ进行酶切,回收片段。1. 1. 3　将( 1. 1. 1)回收的载体和( 1. 1. 2)回收的片段连接转化及质粒扩增后回收质粒, 用 SacⅠ将质粒线性化。在1. 5 Eppendorf 管中加入以下成分: 5×T 7转录酶缓冲液10 Ll, 2. 5 mmol / L 的 rAT P,rGTP, rCT P, rUT P 各2. 5 Ll, 1 mol / L DTT 0. 5Ll, 线性化的质粒 DNA 1Lg , RNAsin 10 U , T7RNA 聚合酶20 U,补 DEPC 水至50 Ll ,混匀后稍作离心, 放置于37℃反应2 h。加1 Ll 无 RNA 酶的DNA 酶Ⅰ( 1 mg / ml ) ,混匀后置于37℃反应15 min后回收 RNA。1. 2　拟合标准曲线1. 2. 1　分别在每个1. 5 m l Eppendorf 管中加10, 5,2. 5, 1. 25, 0. 625, 0. 3125, 0. 15625, 0. 078125, 0.0390625 Ll兔心肌总 RNA, 并用 DEPC 水补至10Ll。分别在每管中加稀释200倍的内参 cRNA 各1. 5Ll。在每管中加下游引物 R1 20 pmol混匀放入70℃变性10 m in。取出后冰浴5 m in, 并加入5×AMV 反转录酶缓冲液4 Ll, 10 mmol/ L 的 dNTP 0. 5 Ll,RNAsin 1 U, AMV 反转录酶2 U, 并用 DEPC 水补至20 Ll后混匀并稍加离心。42℃温育1 h。在0. 5 mlEppendorf管中加入10×不含Mg2+的 Taq DNA 聚合酶缓冲液2 Ll, 上游引物 F1和下游引物 R1各10pmol/ L , 25 mmol/ L 的MgCl 21. 2 Ll, 10 mmol / L 的dNT P 混合物0. 4 Ll, T aq DNA 聚合酶1 U, 反转录产物0. 5 Ll, 加双蒸水补至20 Ll。按以下程序进行扩增: 94℃ 5 min 预变性; 94℃ 40 s, 56℃ 40 s, 72℃50 s 循环35次; 72℃ 7 min延伸。1. 2. 2　PCR 结束后,加上琼脂糖上样缓冲液后在15 g / L 的琼脂糖上电泳,并用溴化乙锭染色拍成照片。将照片扫描入计算机,并测定每一条泳道的背景光密度值及内参带、样品 DNA 带的光密度值。按以下公式计算样品中 AT 1R的 RNA的量。样品AT 1R 的RNA 量=(样品 DNA 带的光密度值- 背景光密度值)×内参 RNA 的浓度×内参体积(内参带的光密度值- 背景光密度值)×样品 DNA 的体积1. 3　统计方法　采用直线相关与回归拟合标准曲线及计算相关系数, 应用软件 为 SPSS FORWINDOWS。2　结果2. 1　制作标准曲线的 Q T-PCR 扩增结果电泳照片(图1)。2. 2　标准曲线图　图中散点为实际观测值, 直线为根据此散点拟合的直线(图2) ,方程为 y= 0. 4970+0. 8038x (相关系数 r = 0. 998, 经方差分析 p= 0.000)。图1　定量 PCR 扩增的电泳照片上方的条带为血管紧张素Ⅱ的 1型受体 mRNA 扩增带, 下方为内标准RNA 扩增的带图2　标准曲线拟合图·433·心 脏 杂 志 ( Chin Hear t J) 2000, 12( 6)3　讨论　　随着人们对 AT 1研究的增多, 在各种情况下AT 1 mRNA 的定量也越来越重要, 但目前人们对AT 1 mRNA 的定量仅限于在大鼠的一些研究中,而很少在其他的动物中进行,其主要原因就是由于在对其他的动物进行 AT 1的 mRA 的定量时会出现方法选择上的困难。　　目前对 mRNA 进行定量的方法主要有Northern、斑点及狭线杂交、核酶保护分析法和引物延伸法等方法 [ 1] , 但这些方法的敏感性低而在mRNA 的含量变化较少时则无法检测出来, 而定量PCR( QT -PCR)方法则可以解决这种敏感性的问题。QT -PCR是当前精确定量分析基因表达的一种最快速、敏感的方法。与传统的 RNA 分析方法相比具有: ¹ 敏感性高。QT -PCR从理论上讲可以检测出一个高度混合的样品中某一特定单拷贝 RNA 分子,比传统的 RNA 印迹杂交技术敏感1000～10000倍。º特异性强。由于扩增过程中选用某一严格的内标准它可以使仅差数个碱基的模板区分开。»能快速分析大量的样品。因而在 RNA 水平定量分析中有逐渐取代 Northern 印迹杂交和核酶保护分析法的趋势。　　但 PCR扩增是指数扩增,控制反应率的任何一个参数发生微小的变化,就会影响产物的量。这些参数如PCR体系中任一物质的浓度、复性及延伸的温度等。而且即使这些因素都被精确地控制和优化,也还存在不同反应管中的产量差异(试管效应)。因而需要设立内标准作为对照进行 QT -PCR。　　目前 QT -PCR的内标准有两个方面:一种是组织细胞普遍表达而且表达较恒定的一类 mRNA ,另一种是人工合成的 cRNA 作为内参。组织内恒定表达的 mRNA 由于应用两对引物可能会在反转录及PCR 扩增时出现效率上的差异, 且这种 mRNA 在不同个体的组织内的表达的量并不完全一致,因而使其在定量的准确性上受到一定的影响, 只能作为一种半定量的方法。人工合成的 RNA 一般为利用内标准 RNA 和待扩增的 RNA 在结构上的变异,且这种变异会产生一个内切酶的位点,然后利用这个位点插入/消除一个片段使其在大小上与待扩增的片段分开,或在扩增后利用内切酶将具有内切酶位点的片段切开,以使两者分开。　　本实验中由于兔 AT 1 mRNA 的序列中没有适当的内切酶位点,因而作者选择利用 Balb/ c小鼠的AT 1基因, 其中含有 EcoRⅠ位点,在这两个序列中完全相同序列中合成了一对引物, 这样可以利用Balb/ c 小鼠的基因合成内标准 RNA, 但在实验中作者无论应用插入或去除一个片段所合成的 RNA以及这个片段本身所合成的 RNA 均在反转录时不能反转录成 cDNA ,因而无法作为内标准使用,估计是由于合成的 RNA 的二级结构复杂导致反转录效率低下所致。因此,为了消除这种二级结构的影响,作者又设计了一条引物, 利用此引物和原来的上游引物扩增了一个兔的 AT 1的 DNA 片段, 并用这个片段取代 Balb/ c 小鼠基因中 EcoRⅠ位点至上游这一段 DNA, 但新合成的要较被取代片段小。经取代后所合成的新的内标准 RNA 与兔的 mRNA 有共同的引物, 且大小差230 bp。这个新合成的内标准RNA 很好地消除了二级结构对反转录的影响,在进行标准曲线的制作中所测的结果进行曲线拟合的相关系数达0. 998。因而可以说明利用此新合成的内标准RNA进行QT -PCR可以准确地检测 AT 1的表达量。　　另外,在设计此内标准 RNA 时,作者考虑将来在检测人的AT 1mRNA 的需要,将所设计的引物与人的AT 1mRNA 的序列也有较高的同源性, 仅需进行简单的改造即可用于人的AT 1mRNA 的检测。同时合成此内标准 RNA 具有简单、方便的特点。参考文献:[ 1 ] Sadoshima J , Lzumo S . Molecular characteriz at ion ofangiotensin Ⅱ-induced h yp ert rophy of cardiac myocytes andhyper plasia of cardiac f ibroblast s . C rit ical role of the AT 1receptor subtype[ J] . Circ Re s, 1993, 73( 3) : 413.[ 2 ] Li JS, T ouyz RM, S chif f rin EL. E ffect s of AT 1 and AT 2angiotensin r eceptor an tagonis ts in angiotens in Ⅱ-infusedrat s [ J ] . Hp er tension, 1998, 31: 487.[ 3] Kim S , Ohta K, Hamaguch i A, et al . Angiotens in Ⅱ t ype 1receptor antagonist inh ibit s the gene expression oftr ans form ing gr ow th factor -b eta 1 and ex tracellular m at rix incardiac and vascular t iss ues of hyper tensive rats [ J ] . JPhar macol E xp T her , 1995, 273: 509.[ 4] Kim S , Lw ao H. In volvement of ang iotensin Ⅱ in car diovascularand renal in jury: ef fect s of an AT 1-receptor antagon ist ongene expression and the cellu lar phen otype[ J ] . J Hyp er tensSupp l , 1997, 15: S 3.[ 5] J u H , Zhao S, Jass al DS, et al. Ef fect of AT 1 receptor blockadeon cardiac collagen remodeling af ter m yocardial infarct ion[ J] .Cardiovasc Res, 1997, 35: 223.(收稿 1999-09-28)·434· 心 脏 杂 志 ( Chin Hear t J) 2000, 12( 6)

定量反转录PCR检测血管紧张素Ⅱ的1型受体内标准的构建

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