目的本实验拟通过阐明全反式维甲酸(ATRA)与MEK1/2的特异性抑制剂PD98059联合作用对结肠癌细胞增殖的影响。方法实验分组:未加药对照组,ATRA加药组,ATRA与PD98058联合加药组。MTT法检测PD98059联合ATRA对结肠癌细胞株LS174T的增殖抑制作用。流式细胞仪检测结肠癌细胞凋亡情况。结果 MTT法显示PD98059联合ATRA应用引起细胞抑制效果明显优于单个药物作用的效果。流式细胞仪检测也表明两种药物联合应用引起结肠癌细胞凋亡效果明显优于任一单个药物。结论 ATRA与PD98059联合应用可通过引起结肠癌细胞凋亡,从而抑制癌细胞增殖

朱留伟

殷平

田瑞华

金光辉

陈艳

Xiamen University Institutional Repository

2011 年 3 月第 18 卷第 3 期结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤， 其发病率在我国仅次于胃 癌 和 食 道 癌， 居 消 化 道 恶 性 肿 瘤 的 第 3 位。 全 反 式 维 甲 酸（ATRA） 属于维生素 A 类化合物家族， 能够诱导多种肿瘤细胞分化或抑制肿瘤细胞的增殖。 PD98059 是 ERK1/2 信号通路 中的一种细胞渗透性和选择性的特异性阻断剂。 本实验旨在阐明两种药物对结肠癌增生的影响。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂RPMI1640 培 养 液 、 胎 牛 血 清 、 胰 酶 、 青 链 霉 素 均 购 于Hyclone 公司。 ATRA、 PD98059 （MEK 抑制剂）、 MTT、 DMSO购于Sigma 公司； Annexin－ⅴ凋亡试剂盒购于Biomiga 公司。1．1．2 细胞培养结 肠 癌 细 胞 株 LS174T 购 于 中 科 院 上 海 细 胞 生 物 研 究 所 ，用 含10%胎 牛 血 清、 1%青 链 霉 素 的 RPMI1640 培 养 液 ， 在 37℃， 5%CO2 温箱中培养。 待细胞长至铺满瓶底传代。1.2 方法1.2.1 实验分组 MTT 法测细胞增殖水平ATRA 溶 于 无 水 酒 精， PD98059 溶 于 DMSO。 取 处 于 增 殖期的LS174T 细胞以 5 × 104 个/孔密度接种于 96 孔板。 实验分 5组 ： ①10-5mol/L PD98059 预 处 理 30 min 后+10-5mol/L ATRA；②10-6mol/L PD98059 预处理 30 min 后+10-5mol/L ATRA； ③10-7mol/L PD98059 预 处 理30 min 后+10-5mol/L ATRA； ④单 纯 10-5mol/L ATRA； ⑤单纯培养液＋细胞。 每组均设 6 复孔。 实验组分 别 在 加 药2 d 后 终 止 培 养， 每 孔 加 入 MTT （5mg/ml） 20 μL，37 ℃孵育 4 h 后弃上清， 每孔加入 DMSO 150 μL， 摇 动 混 匀，室 温 暗 处 放 置 10 min， 酶 标 仪 570 nm 波 长 测 定 各 孔 吸 光 度（A）。 结果用 x ± s 表示。1.2.2 流式细胞仪检测凋亡以 5 × 105/mL 密度接种 LS174T细胞接种于培养瓶中， 贴壁【摘要】 目的 本实验拟通过阐明全反式维甲酸 （ATRA） 与 MEK1/2 的特异性抑制剂 PD98059 联合作用对结肠癌细胞增殖的影响。 方法 实验分组： 未加药对照组， ATRA 加药组， ATRA 与 PD98058 联合加药组。 MTT 法检测 PD98059 联合 ATRA 对结肠癌细胞株 LS174T 的增殖抑制作用。 流式细胞仪检测结肠癌细胞凋亡情况。 结果 MTT 法显示 PD98059 联合 ATRA 应用引起细胞抑制效果明显优于单个药物作用的效果。 流式细胞仪检测也表明两种药物联合应用引起结肠癌细胞凋亡效果明显优于任一单个药物。 结论 ATRA 与 PD98059 联合应用可通过引起结肠癌细胞凋亡， 从而抑制癌细胞增殖。【关键词】 全反式维甲酸； PD98059； 结肠肿瘤； 凋亡中图分类号： R735.3+5 文献标识码： A doi:10.3936/j.issn.1674-4659.2011.03.0323The Prolition of Colonal Cancer Was Inhibited by Combination of All-trans Retinal Acid (ATRA) and PD98059CHEN Yan 1, YIN Ping 1, JIN Guanghui 2, ZHU Liuwei 2, TIAN Ruihua 3(1Department of Pathology, Zhongshan Hospital, Fujian Medical University, Xiamen 361004, China;2Department of Basic Medical Sciences, Medical College, Xiamen University, Xiamen 361006, China;3Department of Pathology, Xiamen Maternity and Child Care Hospital , Xiamen 361003, China)[Abstract] Objective To illustrate the effect on the growth of colonal cancer by all-trans retinal acid (ATRA) and MEK1/2 inhibitorPD98059. Methods The cells were divided into different groups: control group, the group treated with ATRA (AT), the group preincubatedwith MEK inhibitor PD98059 30 minutes prior to ATRA treatment (PD+AT). The proliferation and apoptosis of the LS174Tcolonal cancercells were observed by MTT assay and flow cytometric analysis. Results By analysis of MTT and flow cytometric, the proliferation of thecolonal cancer cells was obviously inhibited by PD+AT group superior to ATRA group. The apoptotic rate of PD+AT group was much high-er than the control. Conclusion The growth of the LS174T colonal cancer cell was significantly suppressed by ATRA and PD98059.[Key words] All-trans retinal acid (ATRA); PD98059; Colonal tumor; Apoptosis收稿日期： 2010-12-19 修回日期： 2011-01-25基金项目： 厦门市科技局基金资助项目 （No．3502Z20074019）作者简介： 陈艳 （1977- ） 女， 福建福清人， 住院医师， 硕士研究生在读， 研究方向： 肿瘤分子病理学。全反式维甲酸与 PD98059 联合应用抑制结肠癌细胞的增殖陈艳 1， 殷平 1△， 金光辉 2， 朱留伟 2， 田瑞华 3（1 福建医科大学教学医院－厦门大学附属中山医院 病理科， 福建 厦门 361004；2 厦门大学医学院 基础医学部实验室， 福建 厦门 361006；3 厦门市妇幼保健院 病理科， 福建 厦门 361003）·论著·（实验研究）·323·2011 年 3 月第 18 卷第 3 期PD98059（mol ／ L）- --ATRA（mol ／ L）10-7 10-6 10-510-5 10-510-510-5后 换 以 无 血 清 饥 饿 培 养 24 h， 按 分 组 加 药， 2 d 后 收 集 细 胞，使重悬于 200 μL Bingding Buffer， 分别加入 5 μL Annexin V 和5 μL PI， 轻 轻 混 匀 ， 避 光 室 温 反 应 15 min， 加 入 300 μLBingding Buffer， 1 h 内上流式细胞仪检测。 实验重复 3 次。1.3 统计学分析采用 SPSS 13.0 统计软件包统计分析， 以 one-way ANOVA进行方差分析， 配对 t 检验。 数据以均数 ± 标准差 （x ± s） 表示， 以P <0.05 作为有统计学意义的检验标准。2 结果2.1 PD98059 与 ATRA 联合应用明显抑制 LS174T 细胞增生结肠癌 LS174T 细胞在不同条件下培养 48 h 后， MTT 法检测其生长状况： LS174T 细胞株经单纯 10-5mol/L ATRA 作用后，细胞吸光度明显低于正常不加药对照组。 差异有高度显著性意义（P ＜0.01）。 而用不同浓度 10-5、 10-6、 10-7mol/LPD98059 预处理 LS174T 细 胞 半 小 时 后 加 入 10-5mol/L ATRA， 发 现 结 肠 癌 细胞抑制率随药物作用浓度的上升而升高。 提示PD98059 浓度越高， 细 胞 抑 制 程 度 越 大。 且 比 单 用 ATRA， PD98059 与 ATRA联用明显抑制了细胞增生 （F=4.2606， P <0.05， 见图 1）。2.2 PD98059 与 ATRA 联 合 应 用 引 起 结 肠 癌 LS174T 细 胞 凋亡效果更显著我 们 运 用 Annexin V 和 PI 双 重 标 记 激 发 LS174T 细 胞 株 ，用流 式 细 胞 仪 分 析 LS174T 细 胞 的 凋 亡 情 况。 结 果 如 表 1 图 2所 示： 应 用 ATR A （10－5mol ／ L） 处 理 细 胞 48 h 后， 细 胞 凋 亡率（UR＋LR） 为 25．17％， 与对照组结肠癌细胞 （18．1％） 相比，差异有统计学意义 （P ＜0．05）， ATRA 与 PD98059 共 同 作 用 后诱导效果明显， 凋亡率上升至 26．53％， 30．33％， 32．47％ （P ＜0．01）， 可见应用 PD98059 抑制 ERK 信号通路后可部分增强结肠癌细胞对 ATR A 的敏感性。表 1 ATRA、 PD98059 作用于 LS174T 细胞 2 天后细胞凋亡率配对 t 检验： 单纯 ATRA 实验组 vs 正常对照组， t＝6．23， P ＜0．05， n＝3。F 检 验： 正 常 对 照 组 vs 不 同 浓 度 PD98059＋ATRA 组 ， F＝187．9， P ＜0．01， n＝12。图 2 PI 染色流式细胞仪分析 LS174T 细胞凋亡图UL、 UR、 LL、 LR 分别指图中的左上、 右上、 左下、 右下象限。Figure 2 By analysis of flow cytometric, the apoptosis of tumor cells wassignificantly higher by the combination of PD98059 and ATRA than byATRA．3 讨论研究报道 ATRA 可诱导肿瘤细胞的分化， 诱导肿瘤细胞的凋亡， 使细胞周期阻滞于 G0 ／ G1 期， 减缓了肿瘤细胞内的能量代谢，， 增强自然杀伤细胞识别肿瘤细胞的能力， 从而增 强 抗肿瘤作用。 他可通过 RAR－ RXR 等多条途径影响细胞代谢［1］。MAPK 家族由 4 条主要特征性信号途径组成： 细胞外信号调节激酶 （ERKs）， c－Jun 氨 基 端 激 酶 ／ 应 激 活 化 蛋 白 激 酶（JNK ／SAPK）， P38 激酶及细胞外信号调节激酶 5 通路（ERK5） 家族。他们之间存在着相互窜话关系。 ATRA 可通过抑制 JNK ［2］， 激活P38 ［3］ 等信号途径抑制癌细胞增生。 有资料表明在SKBR－3乳腺癌细胞系中 ATRA 抑制细胞生长， 但同时降低ERK 的磷酸化 ［4］， 但在小鼠胚胎上颚间充质细胞则可激活此通路 ［5］。 ATRA对不同细胞株 ERK1 ／ 2 信号通路影响不同， 本实验 ATRA 抑制结肠癌细胞增生对ERK1 ／ 2 信号通路的影响有待进一步证实。ERK1 ／ 2 信号转导通路的异常活化能够导致细胞异常增殖，恶性转化， 并丧失凋亡和分化的能力， 促使肿瘤产生。 PD98059特异性抑制 MEK1 ／ 2， 能有效抑制 ERK 的活化， 从而抑制某些图 1 柱 形 图 示 PD98059、 ATRA 作 用 2 天 后 结 肠 癌LS174T 细 胞 的A570 nm 值Figure 1 MTT assay for LS174T cell growth after PD98059 and ATRAtreatment. The cell proliferation was significantly inhibited by PD98059 andATRA than by ATRA after 2 days.配对 t 检验： 单纯 ATRA 实验组 vs 正常对照组， t=35.01， P <0.01。F 检验： 正常对照组 vs 不同浓 度 PD98059+ATRA 组， F=4.2606， P <0.05。组别 凋亡率 （％）对照组 18．110－5mol ／ L ATRA 25．1710－5mol ／ L ATRA＋10－7mol ／ LPD98059 26．5310－5mol ／ L ATRA＋10－6mol ／ LPD98059 30．3310－55mol ／ L ATRA＋10－5mol ／ LPD98059 32．47对照组 10－5mol ／ L ATRA·324·2011 年 3 月第 18 卷第 3 期（责 任 编 辑： 常 海 庆）肿瘤细胞的增殖、 存活。 Davies 等 ［6］ 亦证 实 应 用PD98059 后Hela细胞上 ERK 磷酸化水平降低， 细胞增殖受到抑制。此次实验用 PD98059 特异性阻断 ERK 信号通路后， ATRA对结肠癌细胞增生的抑制的效果更显著。 有报道称活化的 ERK信号通路可促进 P3 蛋白磷酸化， 抑制促凋亡蛋白 （Bad， Bim）的 活 性 或 表 达 ， 引 起 抗 凋 亡 蛋 白 （Bcl－2， Bcl－Xl） 的 表 达 ；PD98059 作为特异性 MEK ／ERK 抑制剂， 可抑制 P53 蛋白磷酸化 ［7-9］。 而 ATRA 诱导细胞后， 可抑制 P53 蛋白降解， 导致与凋亡相关的信号途径被激活 （CASPASE3 表达上调） ［10］。 我们推测： PD98059 与 ATRA 两种药物可能通过共同的P53 信号途径发挥协同作用， 引起结肠癌细胞凋亡， 从而有效的发挥抗癌作用。总之， 由于肿瘤发生机制的复杂性， 寻找有效的药物联合化疗是目前较积极的治疗手段。 以上对 PD98059 与 ATRA 两种药物作用机制的初步探讨， 有助于我们进一步优化化疗方案，在部分程度上为肿瘤的治疗展开新的前景。参考文献[1] 王顺义. 维甲酸的代谢及作用方式[M]. // 肿瘤的诱导分化和凋亡疗法. 上海: 上海科学技术出版社, 1998: 65-66.[2] Lee HY, Walsh GL, Dawson MI, et al. All-trans-retinoic acid inhibitsjun N-terminal kinase-dependent signaling Pathways[J]. J Biol Chem,1998, 273 (12): 7066-7071.[3] Yazan Alsayed, Shahab Uddin, Nadim Mahmud, et al. Activation ofRac1 and the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in re-sponse to all-trans-retinoic acid [J]. J Biol Chem, 2001, 276 (6):4012-4019.[4] Shino Nakagawa, Teruhiko Fujii, GoroYokoyama, et al. Cell growthinhibition by all-trans retinoic acid in SKBR-3 breast cancer cells: In-volvement of protein kinase C and extracellular signal-regulated kinasemitogen-activated protein kinase [J]. Mol Carcinog, 2003, 38 (3):106-116.[5] Zengli Yu and Ying Xing. All-trans retinoic acidinhibited chondrogen-esis of mouse embryonic palate mesenchymal cells by down-regulationof TGF-β/Smad signaling [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006,340 (3): 929-934.[6] Davies CC, Mason J, Wakelam MJ, et a1. Inhibition of phosphatidyli-nositol 3-kinase- and ERK MAPK-regulated protein synthesis revealsthe pro-apoptotic properties of CD40 ligation in carcinoma cells[J]. JBiol Chem, 2004, 279 (2): 1011-1019.[7] Schuler M, Green DR. Transcription, apoptosis and p53: catch-22 [J].Trends Genet, 2005, 21 (3): 182-187.[8] Balmanno K, Cook SJ. Tumour cell survival signalling by the ERK1/2pathway[J]. Cell Death Differ, 2009, 16 (3): 368-377.[9] Kojima K, Konopleva M, Samudio IJ, et al. Mitogen-activated proteinkinase kinase inhibition enhances nuclear proapoptotic function of p53in a cute myelogenous leukemia cells [J]. Cancer Res, 2007, 67 (7):3210 -3219.[10] Paul Mrass, Michael Rendl, Michael Mildner, et al. Retinoic acid increases the expression of p53 and proapoptotic caspases and sensitizeskeratinocytes to apoptosis: a possible explanation for tumor preventiveaction of retinoids [J]. Cancer Res, 2004, 64 (18): 6542-6548.                                         2011 年 杂志征稿18 年来风雨路◇1994 年创刊◇2008 年更现名◇国内统一刊号： CN 44-1655/R◇国际标准刊号： ISSN 1674-4659◇国内邮发代号： 46-130◇国外发行代号： M8885三年成绩步步高◇刊名题写： 韩启德 （全国人大常委会副委员长， 九三学社中央 主 席， 中 国 科 学 技 术 协 会 主 席， 北 京 大 学 医 学 部 主 任 、 教授， 中国科学院院士）◇加入数据库： 万方数据 （Wanfangdata）， 中国知网 （CNKI），维普资讯 （VIP）， 台湾华艺 （Airiti Library）（http://www.lcyxgc.com/articles/about/BeiShouLuQingKuang/）◇最近三年可被引文献量 （%）： 300 （59%）， 421 （89%）， 828 （97%）◇最近三年影响因子 （Impact Factor）： 0.049， 0.225， 0.322原则灵活双坚持◇审稿原则： 引用不超过 30%◇版式特色： 不接排， 不转版， 方便查阅， 方便复印◇栏目设置： 专家述评 （特别报道）； 论著 （基础研 究； 实 验研究； 临床研究； 中医中药； 护理研究； 医学工程； 调查与统计； 卫生管理）； 短篇报道； 教学研究； 综述◇绿色通道： 基金论文， 研究生毕业论文满怀信心话未来◇中国科学引文数据库 （CSCD） 来源期刊◇中国科技论文统计源期刊 （中国科技核心期刊）◇中文核心期刊◇1 至 3 家国际权威数据库《临床医学工程》 编辑部地址： 广东省广州市广州大道北 507 号 邮编： 510500电话： （020） 36013508； 87211107http://www.lcyxgc.comE-mail： lcyxgc001@126.com； lcyxgc006@sina.com·资讯··325·

全反式维甲酸与PD98059联合应用抑制结肠癌细胞的增殖

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