目的　以 RT- PCR检测胃周淋巴结胃癌转移细胞并评价其临床应用价值。　方法　以 MUC1c DNA的特异序列为 RT- PCR引物 ,酶切分析法及系列稀释法对该法的特异性和敏感性进行分析 ,对临床收集的胃周淋巴结样品作 RT- PCR检测及产物 DNA点杂交验证。　结果　 ( 1)胃及胃癌组织均存在 MUC1m RNA的表达 ;( 2 )该扩增体系具有较好的特异性 ;( 3)敏感性可达 1pgRNA,相当于从 10 5个淋巴细胞中检出 1个胃癌细胞 ;( 4)对临床样品检测的结果显示较病理检查敏感 ,PCR产物点杂交进一步证实 MUC1作为 PCR标志物有较好的可靠性。　结论　该法具有较高的可靠性和较好的应用前景

吴艳环

林岚

苏金华

邱达泰

陈瑞川

Xiamen University Institutional Repository

RT-PCR扩增MUC1检测胃癌微转移研究*陈瑞川1　林　岚1　邱达泰2　苏金华1　吴艳环3* :福建省卫生厅科研基金资助课题( 96075)1. 厦门大学抗癌中心(厦门　361005)2.厦门市思明区人民医院内科(厦门　361005)3. 厦门市中山医院消化科(厦门　361005)目的　以 RT -PCR 检测胃周淋巴结胃癌转移细胞并评价其临床应用价值。　方法　以M UC1cDNA 的特异序列为 RT -PCR 引物, 酶切分析法及系列稀释法对该法的特异性和敏感性进行分析, 对临床收集的胃周淋巴结样品作 RT -PCR 检测及产物 DNA 点杂交验证。　结果　( 1)胃及胃癌组织均存在 M UC1 mRNA 的表达; ( 2)该扩增体系具有较好的特异性; ( 3)敏感性可达 1 pgRNA ,相当于从 105个淋巴细胞中检出 1 个胃癌细胞; ( 4)对临床样品检测的结果显示较病理检查敏感, PCR 产物点杂交进一步证实 M UC1 作为 PCR标志物有较好的可靠性。　结论　该法具有较高的可靠性和较好的应用前景。关键词　胃癌, 转移; 反转录多聚酶链反应检测; 多形上皮细胞粘蛋白　　目前癌转移的临床检测多靠病理检查,敏感性较差。反转录多聚酶链反应 ( RT -PCR)检测癌淋巴结微转移的原理是选择肿瘤起源组织有表达而被转移组织不表达的基因转录产物作为 RT -PCR扩增标志物,通过RT -PCR 扩增检测淋巴结总 RNA 中是否有该靶基因的转录产物,以判断是否存在转移的癌细胞 [ 1]。因此, 选择合适的 RT -PCR 扩增标志物是关键之处。M UC1是多形上皮细胞粘蛋白( polymo rphic epo thelial mucin)的核心蛋白基因[ 2], 已有人将其应用于 RT -PCR 检测乳腺癌细胞淋巴结微转移[ 1], 但尚未见用于检测胃癌细胞淋巴结微转移的报道,而且该基因在胃及胃癌组织中的表达状况 也 不 清 楚。本 文 参 考 文 献 [ 1 ] 以M UC1 cDNA的特异序列为 RT -PCR 引物,初步探讨 MU C1 m RNA 作为标志物用于RT -PCR 检测临床胃周淋巴结样品微转移胃癌细胞的前景。1　材料与方法1. 1　试剂及样品1. 1. 1　试剂　反转录酶、Taq 酶、内切酶等均为 Promega 产品, DIG DNA 标记及检测试剂盒为宝灵曼公司产品, 有关的生化试剂等购自华美生物工程公司上海分公司, 其余均为国产分析纯。1. 1. 2　细胞及组织样品　人胃腺癌 M GC-803及人早幼白血病 HL-60细胞株为本单位细胞生物学研究室保存;常规方法培养。胃周淋巴结样品分别取自胃癌患者手术切除标本( 40例)和非癌患者胃手术切除标本( 11例) ,胃及胃癌活检样品取自行胃镜检查患者(共25例)。样品均做病理常规检查,其中淋巴结样品镜检证实转移阳性者 32例, 阴性者 19例。外周血取自健康人, 常规方法分离白细胞。1. 1. 3　引物合成　M UC1及 -actin 的引物序列[ 1] :M F: 5'-GGT ACCTCCT CT CACCTCCTCCAA-3'M R : 5'-CGT CGTGGACATTGATGGT ACC-3'AF : 5'-TCATCACCATT GGCAAT GAG-3'AR: 5'-CACTGTGTTGGCGTACAGGT-3'以 cDNA 为模板, M F + M R 的扩增产物长 288 bp; AF+ AR 的扩增产物长为 154bp; 以基因组 DNA 为模板的扩增产物,前者长 536 bp,后者为 254 bp。引物均由上海生244 J ou rnal of Fu jian Medical University　Vol. 33　S ep. , 1999工公司合成。1. 2　总 RNA 提取　按 Chomczynski 的一步法[ 3]。1. 3　反转录　参照文献[ 4]以 AM V 反转录酶及随机引物进行反转录。1. 4　PCR扩增　参照报道方法[ 2] ,产物以2%琼脂糖电泳分析。1. 5　PCR 产物的酶切鉴定　根据 -act in及 MU C1 PCR扩增产物的序列,以DN ASIS软件分析内切酶位点,选择 HinfⅠ和 Hae Ⅲ按常规方法对上述两种扩增产物进行酶切,聚丙烯酰胺凝胶电泳后 EB 染色观察。1. 6　PCR产物的点杂交验证　取 RT -PCR扩增产物经碱变性后于 12×8孔的点膜器上点于硝酸纤维膜, 80℃烤 2 h。另取上述经酶切鉴定及低熔点琼脂糖电泳纯化的 PCR 产物为模板, 按 DIG DNA 标记检测试剂盒说明进行探针标记及杂交检测[ 5]。2　结　果2. 1　胃及胃癌组织的 RT -PCR扩增检测　胃活检标本及胃癌组织以 RT -PCR 检测M UC1 mRNA, 显示均有 MU C1基因表达,而 HL-60及正常淋巴结仅有 -act in 表达。表明 M UC1 mRNA 可用作胃癌淋巴结微转移检测的标志物。2. 2　RT -PCR 的扩增特异性　由 DN ASIS软件系统分析结果, M U C1的 RT -PCR产物经 Hinf I 酶切后可产生 248 bp及 40 bp 的片段, 经 HaeⅢ酶切后产生 202, 33, 31及 22bp的片段; -actin 的 PCR 扩增产物经 HinfⅠ酶切后产生 86 bp及 68 bp 的片段(图 1)。上述 M UC1 及 -act in 的部分 PCR 产物分别经 HinfⅠ或 HaeⅢ酶切后电泳分析显示,酶切后产生的片段均正确, 表明 M U C1 m R-NA 用作RT -PCR的标志物有较好的扩增特异性。2. 3　RT -PCR 的检测敏感性　来自 M GC-803总 RNA 的反转录产物按 10倍稀释后各图 1　部分样品 RT-PCR 扩增产物的酶切分析结果Ma: pGEM-3Zf ( + ) /HaeⅢ m ark er; 1: HL-60; 2:淋巴结; 3: 外周血白细胞; 4: -act in; 5, 8: MGC-803; 6, 9:胃活检标本; 7: M UC1取 1 l(相当于 100 ng , 10 ng , 1 ng , 100 pg ,10 pg , 1 pg , 100 fg RNA ) , 再各加外周血白细胞 RNA 反转录产物 1 l (相当于 RNA0. 1 g)混合作为模板, 分别以 MU C1及 -act in 的引物进行 PCR 扩增, 扩增后将M UC1 及 -actin 的扩增管中 PCR 产物混匀,电泳分析结果见图 2。检测敏感性达 1 pgRN A,该敏感性相当于从 105个淋巴细胞中检测出 1个胃癌细胞。图 2　RT -PCR 的检测敏感性分析Ma: pGEM-3Zf ( + ) / HaeⅢ mark er; A: -act in; M :MU C1; 1～ 7: 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100fg M GC -803 RNA2. 4　临床样品的 RT -PCR分析　以 M UC1引物及 -act in引物分别对所收集的胃周淋巴结样品进行 RT -PCR检测。40例来自胃癌245福建医科大学学报　1999年 9月　第 33 卷　第 3 期患者的标本中 RT -PCR检测和病理切片检查均转移阳性者为 32例,另 8例病理检查阴性者中有 5例被 RT -PCR检测阳性(图 3) ;来自非胃癌患者(无癌细胞)的 11例胃周淋巴结标本, RT-PCR 检测和病理检查结果均阴性,表明 RT-PCR 检测敏感性较病理检查法高(附表)。图 3　病理检查阴性胃周淋巴结样品的 RT -PCR 检测结果Ma: pGE M-3Zf ( + ) / HaeⅢ marker; 1, 2:病理检查阳性胃癌淋巴结样品; 3～10: 病理检查阴性胃癌淋巴结样品( 其中 8～10 MUC 1阴性) ; 11, 12:非胃癌胃周淋巴结样品.附表　胃周淋巴结样品 RT-PCR 检测与病理检查结果比较RT -PCR检测病理检查阳性 阴性 合计阳性 32 5 37阴性 0 14 14合计 32 19 512. 5　PCR 产物的点杂交验证　以上述 RT -PCR 产物点膜, 分别以 -act in 及 M UC1 的DIG 标记探针进行杂交检测,以 -act in探针杂交检测所有产物均阳性; M UC1探针检测显示上述 RT -PCR 检测阳性者( 37 例)均有杂交信号,阴性者( 14 例)则无,表明 M UC1作为 RT -PCR检测胃癌淋巴结微转移标志基因有较好的可靠性。部分胃周淋巴结样品RT -PCR产物的点杂交检测结果见图 4。3　讨　论M UC1 是多型上皮细胞粘蛋白的核心蛋白基因,已被证实在淋巴细胞中不表达[ 2] ,图 4　病理检查阴性胃周淋巴结样品 RT -PCR 产物的 DNA 点杂交结果M: M UC1探针杂交; A : -act in探针杂交; a1～4, c1～4:病理检查阳性胃癌淋巴结样品; a5～12, c5～12:病理检查阴性胃癌淋巴结样品; b 1～11, d1～11:非胃癌淋巴结样品; b 12, d12:生理盐水对照 .而在乳腺癌[ 1]、胆管癌[ 2]等上皮源肿瘤细胞中有表达。Noguchi的报道证实M UC1可用于检测乳腺癌淋巴结微转移 [ 3] , 敏感性达 1个乳腺癌细胞/ 106 个淋巴细胞, 但未见有其他应用报道。胃癌为上皮源细胞,笔者推测胃癌细胞也应有 M UC1基因表达。本文以RT-PCR 方法对胃活检标本及胃癌组织进行了检测,发现 M UC1基因在胃及胃癌组织的表达率为 100%, 表明 M UC1 mRNA可作为检测胃癌淋巴结转移的标志物。对检测敏感性的分析显示本法可从 105 个淋巴细胞中检测出 1个胃癌细胞,比 M ori报道 [ 6]的以 CEAmRNA 为标志物检测胃癌淋巴结转移的敏感性高 10倍, 也较病理探查结果更敏感; 但比 Noguchi报道[ 2]的敏感性低。这一方面可能与各作者的标定方法不同有关,另一方面是否与 M UC1 在胃癌及乳腺癌细胞表达量不同有关尚待探讨。RT -PCR 检测的敏感性已被公认, 但也常出现非特异扩增[ 7]; 由于目前尚无较 RT-PCR 更敏感的方法来对 RT-PCR 的临床检测结果的特异性进行验证, 本文尝试以酶切分析法及 DNA 点杂交法对扩增产物进行分析,其根据在于若能证实扩增产物的特异性即可确定 RT -PCR检测结果的可靠性 [ 7] ; 同246 J ou rnal of Fu jian Medical University　Vol. 33　S ep. , 1999时对临床样品也作了选择, 特选了取自非胃癌患者手术标本(不存在胃癌转移)淋巴结来进行 RT -PCR检测, 较全面地考察了本法的特异性, 显示 M UC1 作为 RT -PCR 法检测胃癌淋巴结转移的标志基因具有较高的可靠性及应用价值。此外,本法对于乳腺癌 [ 4]等上皮源肿瘤淋巴结微转移以及外周血中转移胃癌细胞的检测可能尚有一定的应用价值。参考文献1　Noguchi S, Aih ara T , Nak amori S , et al . The detect ionof breas t carcin om a m icrometas tases in ax illary lym phnodes by mean s of reverse t rans criptase-p olymer as echain react ion. Canc er, 1994; 74: 15952　Zotter S , Hagem an C, L os snit zer A, et al . Ti ssue andtum or dist rib ut ion of hu man polymorph ic epithelialm ucin. Cancer R ev , 1988; 11: 553　Ch om czynski P, Sacchi N. S ingle-step method of RNAis olation by acid guanidniu m thiocyanate-phenol-chloro-form ext ract ion. A nal Biochem, 1987; 162: 1564　荆永娜,卢大儒,邱信芳,等 . 影响反转录过程多种因素的探讨 . 细胞生物学杂志, 1998; 20: 385　陈瑞川,杨善民,张　铮,等 . 视黄酸对 BEL-7402细胞酶活性及基因表达的影响 . 厦门大学学报, 1998, 37:2596　Mori M , Mim ori K, Inouc H , et al. Detect ion of can-cer micrometastases in lymph nodes b y r ever se t ran-scriptase-polymeras e chain reaction . Cancer Res, 1995;55: 34177　林万明(主编) . PCR 技术操作和应用指南 . 北京:人民军医出版社,　1993: 39～50RT-PCR Amplifying MUC1 mRNADetection Micrometastases of Gastric CancerChen Ruichuan1 , Lin Lan1, Qiu Datai2, et al( 1.Cancer Research Center , Xiamen Universi ty, Xiamen, 3610052. Si-ming Hospital of Xiamen, Xiamen, 361005)Object ive　T o develop a RT -PCR m ethod to detect g ast ric cancer micrometastases ingastr ic ax illary lym ph nodes f rom gast ric cancer patients.　Methods　T he RT -PCR was setup by using specific prim er of MU C1( co re pro tein of polymor phic epithelial mucin) cDNAand w as f ir st used to estim ate the expression status of M UC1 gene in gastr ic t issue and gas-tr ic carcinomas.　T he specif icity and sensit ivity w er e invest igated w ith enzyme dig estion andserial dilut ion method, respect ively. 　Also, this method w as performed on clinical ax illarylym ph nodes and their PCR products w ere identif ied by dot hybridizat ion to further est im atethe reliability. 　Results　( 1) M UC1 gene expressed in gastr ic and gast ric cancer cells. ( 2)The method po ssessed a high specif icity. ( 3) The detect ion sensit ivity of this system w asabout one gast ric cancer cel l in 105lymph cells. ( 4) T he test results perfo rmed on clinicalgastr ic ax illar y lymph nodes show ed that the m ethod w as m ore sensit ive than patholog icalexamination and do t hybridization test further show ed a high reliability w ith M UC1 as thePCR targ et gene. 　Conclusion　T he RT-PCR m ethod has a high reliability and an applica-tion promise in clinical pract ice.Key words　gast ric cancer, metastases; RT-polym erizat ion chain r eact ion; polymor phicepithelial m ucin(收稿: 1999—05—04 修回: 1999—07—05)247福建医科大学学报　1999年 9月　第 33 卷　第 3 期

RT-PCR扩增MUC1检测胃癌微转移研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/53942/RT-PCR%e6%89%a9%e5%a2%9eMUC1%e6%a3%80%e6%b5%8b%e8%83%83%e7%99%8c%e5%be%ae%e8%bd%ac%e7%a7%bb%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

RT-PCR扩增MUC1检测胃癌微转移研究

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Xiamen University Institutional Repository