P-TEFb是调控真核基因转录延伸的核心转录因子之一,为大多数mRNA转录所必需;与艾滋病、心肌肥大和肿瘤均有密切关系;目前有关P-TEFb的生物学功能及其活性调控机制仍在不断的发现之中。在细胞内,P-TEFb以无活性和可被募集两种复合体存在,并且两种复合体之间可互相转化,以严格维持细胞内P-TEFb的总体活性水平。近年的研究已逐渐揭示P-TEFb活性调控的分子模式,以及调控细胞内P-TEFb活化的信号和分子机理。本文综述近年有关P-TEFb的功能和活性调控机制的研究进展

胡向明

陈瑞川

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·  429  ·《生命的化学》2010 年30卷3期CHEMISTRY OF LIFE 2010，30(3)● 小综述文章编号:  1000-1336(2010)03-0429-05P-TEFb 的功能及其活性调控机制胡向明  陈瑞川厦门大学生命科学学院，厦门 361005摘要：P - T E F b 是调控真核基因转录延伸的核心转录因子之一，为大多数 m R N A 转录所必需；与艾滋病、心肌肥大和肿瘤均有密切关系；目前有关 P - T E F b 的生物学功能及其活性调控机制仍在不断的发现之中。在细胞内，P - T E F b以无活性和可被募集两种复合体存在，并且两种复合体之间可互相转化，以严格维持细胞内 P - T E F b 的总体活性水平。近年的研究已逐渐揭示 P - T E F b 活性调控的分子模式，以及调控细胞内 P - T E F b 活化的信号和分子机理。本文综述近年有关 P - T E F b 的功能和活性调控机制的研究进展。关键词：真核细胞；基因转录延伸期；转录延伸调控；P - T E F b中图分类号：Q 2 9 1收稿日期：2010-01-18国家自然科学基金(No. 30670408；30930046；30470371)；福建省自然科学基金(No. 2008J0108)资助作者简介：胡向明( 1 9 8 5 - ) ，男，博士生，E - m a i l ：xmhu2003@yahoo.cn；陈瑞川(1963-)，男，博士，教授，通讯作者，E-mail：chenrc@xmu.edu.cn基因转录调控实质上是细胞在整合内外信号之后作出应答的平台和手段。从真菌到人类，基因转录遵循相似的基本步骤：转录起始前复合物组装、转录起始、转录延伸和转录结束等[1]。过去，转录起始前复合物组装和调控被认为是细胞应答信号、调节基因转录的核心平台，但近年已逐渐认识到，转录延伸的调控，对细胞调节与发育、生长及应激相关基因的转录表达，也是重要的平台[2]。这些突破性的进展主要得益于对正性转录延伸因子b (positivetranscription elongation factor b, P-TEFb)的功能及其活性调控的研究。1. P-TEFb结构与功能1995年，Price实验室首先从果蝇中分离纯化出P-TEFb。他们在采用一种ATP 类似物DRB(5,6-dichloro-1-β-D-ribofuranosylbenzimidazole)处理细胞时，发现mRN A 转录水平显著下降，且产物多是加帽修饰过的不完整的mRN A 短片段；进一步采用果蝇的体外基因转录模型，发现P-TEFb 就是DRB 的靶蛋白质，并证明P-TEFb 是基因转录从起始状态，转为有效延伸状态的必需因子[3]。该实验室随后一系列的分析鉴定，发现P-TEFb 是由CDK9 及其调节亚基周期蛋白T 组成的异二聚体激酶，其中周期蛋白T 包括T1(约占80%以上)、T2a和T2b，以及极少量的周期蛋白K [4]。研究表明，在mRNA 转录过程中，RNA聚合酶II(Pol II)在合成20~30 nt的mRNA后，由于负性(转录)延伸因子(negative elongation factor，NELF)和 DRB敏感性诱导因子(DRB-sensitivity-inducingfactor, DSIF)的阻抑作用，被暂停在启动子区附近，使加帽机制有充足的时间给新生的mRN A 加帽；但加帽后，阻抑Pol II延伸的机制需被解除，mRNA的合成才能继续进行[1,2,4]。P-TEFb 的功能一方面是通过磷酸化负性延伸因子DSIF 和 NELF 解除这两个因子对转录延伸的抑制作用；另一方面则通过持续磷酸化Pol II大亚基的C-端结构域(CTD)来刺激其转录延伸活性，从而促进全长mRNA 的有效转录[1,2,4]。近年的研究表明，P-TEFb 是绝大多数基因转录表达必需的基本转录因子之一，也是胚胎正常发育的必需因子[2]。虽然，P-TEFb 属于CDK 激酶家族，但起初却认为P - T E F b 并不参与细胞周期的调控。2008 年，美国加州大学伯克利分校周强实验室的研究发现：P-TEFb 可在细胞有丝分裂后末期被募集到染色体上，如果阻断P-TEFb在有丝分裂后末期染色体上的募集，则可导致细胞被阻滞在后G 1 期，而无法进入S 期[5]。提示在调控细胞生长与分化过程中，P-TEFb可能也扮演相当重要的角色。但由于 P-TEFb·  430  ·《生命的化学》2010 年30卷3期CHEMISTRY OF LIFE 2010，30(3)● Mini Review属于必需基因，敲除或抑制 P-TEFb的表达(甚至活性)，对胚胎或细胞均造成致命的后果，因此，有关P-TEFb 在胚胎发育及细胞生长与分化中的作用和机制的研究，至今仍比较少[2]。P-TEFb 不仅是真核基因转录过程中必需的因子，也是艾滋病毒(HIV-1)转录复制过程中必不可少的宿主细胞转录因子之一[1,2]。HIV-1 基因组在转录复制过程中，有很强的自我中止倾向。HIV-1编码的Tat蛋白通过与P-TEFb 特异结合，将P-TEFb 募集到HIV-1 的启动子区，从而克服负性延伸因子对转录延伸的阻抑作用，刺激全长HIV-1 基因组的大量转录复制[1]。2002 年以来，P-TEFb 与心肌肥大的直接关系也被揭示[6]。研究发现：在心肌细胞中，P-TEFb异常活化可直接导致心肌肥大；一些已知的心肌肥大诱因，被证明是通过激活P-TEFb 活性、造成全局性转录增强，最终导致心肌肥大[6]。作为能够影响细胞生长与分化的基本转录因子，P-TEFb 被认为与肿瘤细胞生长可能也有某些关联[2]。因此，象其他重要的细胞因子一样，在正常情况下，P-TEFb 是维持细胞基因转录表达的基本因子，但活性异常时，则可能是一些重大疾病的致病因子。2. P-TEFb活性调控的分子模式2001年之前，P-TEFb作为基本转录因子的一员，被想当然地认为其活性是不受调控的。2001 年，法国的Bensaude 和美国的周强实验室同时发现：P-TEFb与一种被称为7SK的核小RNA (7SK snRNA，以下简称7SK)结合并呈活性受抑制的状态，但对其抑制模式和机制均不了解[2]。2003 年之后，一系列与P-TEFb 活性调控相关的蛋白质被逐个鉴定出来，对这些蛋白质功能的研究，使P-TEFb 活性调控的模式和机制也被逐渐揭示。研究表明：在细胞内，约70~80% 的 P-TEFb 是以无活性的复合体形式存在(简称7SK snRNP)。除P-TEFb和已发现的7SK外，2003年以来，在7SK snRNP中，先后又鉴定出HEXIM1 [7]、HEXIM2 [8]、MePCE/BCDIN3[9]和LARP7/PIP7S[10]四种蛋白质因子(图1)。其中HEXIM1 和 HEXIM2 是高度同源的核蛋白。实验证明：在7SK snRNP中，真正能够抑制P-TEFb活性的不是7SK，而是HEXIM1 或HEXIM2，两者均可借助7SK与P-TEFb结合、并抑制P-TEFb的激酶活性[7,8,11]。通常细胞内80% 以上的7SK snRNP 含有HEXIM1 蛋白，采用RNAi 抑制 HEXIM1 的表达后，发现含有HEXIM2蛋白的7SK snRNP大幅增加，细胞内P-TEFb的总体活性未受干扰[8]，表明HEXIM1 和 HEXIM2 具有功能性互补的关系。2007 年后，在7SK snRNP 中又先后发现MePCE和 LARP7 两个蛋白质因子。研究表明：MePCE 是 7SK特异的加帽酶，该酶通过其甲基转移酶活性在 7SK的5’- 头部形成帽子结构，从而保护7SK 免遭5’- 核酸外切酶降解[9]。而LARP7 是一个具有La结构域的蛋白，该蛋白可通过结合7SK的3’- 尾巴，从而保护7SK免遭3’- 核酸外切酶的降解[10]。但奇怪的是，作为加帽酶的 M e P E C 在完成加帽后，仍留在 7 S KsnRNP 中。新近的研究进一步发现了MePEC 的另一个重要功能[12]：在MePCE 不存在的情况下，LARP7与7SK的3’-尾巴结合极其微弱，实际上无法保护7SK免遭降解；但MePCE 在完成加帽后，转而与LARP7结合，大大增强了LARP7 与 7SK 的相互作用，有效地保护了7SK snRNP 复合体中7SK的稳定性，从而保护7SK snRNP复合体的完整性及其对P-TEFb活性的抑制作用[12] (图1)。除了存在于无活性7SK snRNP的 P-TEFb外，细胞内另有部分P-TEFb 是以有活性的形式存在。起初认为，作为转录延伸因子的P-TEFb 可能是直接被募集到基因启动子上，发挥其刺激转录延伸的功能。但2005年发现[13]，这部分的P-TEFb 可与一种称为Brd4 的双布罗莫结构域蛋白(double bromodomainprotein)结合，并通过Brd4被募集到启动子上[13](图1)。除Brd4外，还发现多种转录因子也能与P-TEFb结合，并将其募集到特异基因启动子上(见图1中的列表)，但这部分的P-TEFb含量极低，也不很清楚其功能[2]。重要的是，当细胞受到外界刺激(如低剂量的放线菌素D、紫外线、细胞诱导分化剂 H M B A 或心肌肥大刺激因子等)时，均可导致细胞内无活性的7SKsnRNP解体并释放P-TEFb[2,5,7]，解离出来的P-TEFb则与Brd4(或其他转录因子)结合，形成可被募集的复合物，从而被募集到基因启动子上，行使其刺激转录延伸的功能[2,13](图 1)。而刺激过后，解离的P-TEFb 又可重新形成无活性的7SK snRNP。新近的报道已直接证实：P-TEFb/Brd4在启动子上的募集作用可被细胞信号所调控[14]。如此，细胞内无活性的7SK·  431  ·《生命的化学》2010 年30卷3期CHEMISTRY OF LIFE 2010，30(3)● 小综述snRNP和有活性的P-TEFb/Brd4复合物之间维持着严格的动态平衡，从而使细胞内P-TEFb 的总体活性受到严格的调控[ 2 ]。该现象提示：细胞内必然存在调控该平衡的信号途径，可根据细胞生长分化及应激的需要，来调控细胞内P-TEFb 的总体活性[2]。3. 细胞内调控 P-TEFb 活化的信号和分子机制有关细胞内调控P-TEFb 活化的信号途径的研究，是从了解P-TEFb 的磷酸化状态、对无活性7SKsnRNP解离的影响开始的[15]。采用体外重组装技术，发现蛋白磷酸酶处理可直接导致7SK snRNP 解离，且去磷酸化处理的 P - T E F b 也失去重新形成 7 S KsnRNP的能力[15]。进一步研究发现：在CDK9 所有可能被磷酸化的位点中，只有CDK9 T环上的第186 位苏氨酸残基(T186)是P-TEFb结合7SK所必需的残基，该位点的突变可导致 P-TEFb 失去结合 7SK 的能力[15]。这些结果提示：CDK9-T186 的去磷酸化可能是调控7SK snRNP 解离的关键机制，从而为后期的信号途径鉴定提供了依据。在随后的信号途径鉴定中，发现钙离子-PP2B[亦称钙调磷酸酶(calcineurin)]和钙离子-蛋白磷酸酶1(PP1)两条信号途径是细胞内调控7SK snRNP解离的主要信号途径(图2) [16]。采用特异性抗磷酸化位点的抗体，证明P-TEFb的组分CDK9-T186的去磷酸化是调控7SK snRNP 解体的磷酸化位点[16]。研究表明：胞外刺激因子可激活钙离子-PP2B 及 PP1 两条信号途径传导，通过PP2B 和 PP1 的两步协同去磷酸化作用，使7SK snRNP复合体解体；其中PP2B的去磷酸化导致7SK snRNP 复合体构象变化，将CDK9-T186磷酸化位点(CDK9/pT186)暴露出来，使PP1得以接近CDK9/pT186 并对其去磷酸化，而该位点的去磷酸化是导致7SK snRNP解体、并释放P-TEFb的关键因素[16](图 2)。进一步的研究发现，Brd4 蛋白所结合的P-TEFb，正是CDK9-T186去磷酸化的P-TEFb (图2)，表明CDK9-T186 位点的去磷酸化不仅是解离无活性7SK snRNP复合体、释放P-TEFb 的关键机制，而且图1　细胞内P-TEFb 活性调控的分子模式图2　钙离子-PP2B 和 PP1信号途径协同去磷酸化解除P-TEFb 抑制模式图·  432  ·《生命的化学》2010 年30卷3期CHEMISTRY OF LIFE 2010，30(3)● Mini Review也是P-TEFb与Brd4结合形成可被募集复合物的前提条件[16]。除PP1 外，另有报道显示：镁离子依赖性蛋白磷酸酶PPM1A 也能使CDK9-T186 去磷酸化，并导致7SK snRNP解体[17]。此外，有研究表明：在HMBA处理的T淋巴细胞内，PI3K/Akt信号途径可通过磷酸化 HEXIM1，从而使 7SK snRNP 解体以释放 P-TEFb[18]，但该现象在HeLa细胞未被观察到[16]，是否仅局限于T 细胞或某种药物处理，尚不得而知。然而，和其他CDK激酶(如 CDK1、CDK2、CDK4和 CDK6 等)一样，CDK9 的 T186 是 T 环上极保守的位点。在多数CDK 中，该位点必须被磷酸化才能使CDK 具激酶活性[19]。我们的结果也显示CDK9-T186去磷酸化的P-TEFb是没有激酶活性的(未发表结果)。因此，这种从无活性7SK snRNP中释放的P-TEFb必须被重新磷酸化才能恢复其激酶活性(重活化)。有趣的是，新近发现：在静息期CD4+ T 淋巴细胞内的P-TEFb恰恰是CDK9-T186去磷酸化的P-TEFb，但细胞被活化后，其CDK9-T186 则恢复为磷酸化状态[20]，提示CDK9-T186 的磷酸化可能涉及T 细胞的活化与增殖。从后生动物到人，目前已知的可以磷酸化CDK T 环上保守苏氨酸位点的激酶仅有一种：即由CDK7/ 周期蛋白H/mat1 组成的CAK[19]。但我们的研究已证实：该CAK不能磷酸化CDK9-T186[15]。提示：细胞内应该存在另一个未知的激酶，负责重新磷酸化CDK9-T186，使P-TEFb 得以重活化。但也有报道认为，T186 去磷酸化的CDK9 可通过自磷酸化，使T186 恢复磷酸化状态[20]，但该结论还未被完全证明。4. 结语目前已充分证明P-TEFb在细胞正常生命活动中的重要功能，也证实了P-TEFb 活性的异常活化与艾滋病及心肌肥大等重大疾病之间的关系。作为核心转录延伸因子，P-TEFb 的活性调控本身不仅涉及复合体解离的分子与细胞信号调控机制，还涉及到P-TEFb 在基因启动子上募集与重活化的分子甚至信号调控机制。然而目前的进展，仅仅是完成了无活性复合体的解离调控这一步。P-TEFb 在基因启动子上的募集以及重活化机制仍是空白；这种重活化的机制究竟具有什么细胞生物学意义，更是有待研究。因此，下一阶段的研究重心，应着重于阐明P-TEFb的在基因启动子上的募集和重活化的调控机制，并探讨P-TEFb 的重活化调控可能具有的细胞生物学功能等方面。参 考 文 献[1] Chen R et al. 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HMBA releases P-TEFb from HEXIM1 and7SK snRNA via PI3K/Akt and activates HIV transcription.PLoS Pathog, 2007, 3: 1459-1469[19] Fisher RP. Secrets of a double agent: CDK7 in cell-cycle controland transcription. J Cell Sci, 2005, 118: 5171-5180[20] Ramakrishnan R et al. Characterization of Cdk9 T-loopphosphorylation in resting and activated CD4+ T lymphocytes.J Leukoc Biol, 2009, 86: 1345-1350The function and regulation mechanism of P-TEFbXiang-Ming Hu, Rui-Chuan ChenSchool of Life Science, Xiamen University, Xiamen 361005, ChinaAbstract    P-TEFb, a kinase composed of CDK9 and cyclin T1, is the core factor for stimulating protein-encoding genetranscription elongation in eukaryotic cell. In addition to play important roles in HIV/AIDS, cardiac hypertrophy and tumorpathogenesis, more and more cell biological functions of P-TEFb are still in discovery. In human cells, P-TEFb exists in twodistinct complexes: one is inactive and unrecruitable complex and the other is active and recruitable one. Through alternativeinteraction with its negative or positive regulators, the total cellular P-TEFb activity can be dynamically regulated in responseto the demands of cell growth or differentiation and extracellular stimulations. In the past years, the regulation model andsignaling pathways of P-TEFb activation have been revealed step by step. Here, these pioneering progressions were summarilyreviewed.Key words    eukaryotic cell; transcriptional elongation; elongation regulation; P-TEFb

P-TEFb的功能及其活性调控机制

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