目的克隆空肠弯曲菌penner o:19 cjaA基因,构建其原核表达载体,诱导表达及纯化蛋白,为基因工程疫苗的研制打下基础。方法扩增空肠弯曲菌penner o:19 cjaA基因,构建pGEM-T-cjaA克隆载体,以EcoRI和XhoI为酶切位点构建pGEX-4T-1-cjaA原核表达载体。表达载体转化E.coli BL21后诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,用Glutathione Sepharose4B纯化重组蛋白。结果成功构建pGEX-4T-1-cjaA表达载体,并获得浓度为10μg/μl的rGST-CjaA重组蛋白。结论成功构建pGEM-T-cjaA克隆载体及pGEX-4T-1-cjaA表达载体,获得重组蛋白rGST-CjaA,为研究空肠弯曲菌疫苗打下基础

徐飞

李鑫

李震中

白欣立

简朔

薛峰

赵子春

邢丛丛

高爱民

Xiamen University Institutional Repository

论 著空肠弯曲菌 penner o: 19 cjaA基因的克隆表达邢丛丛 李震中 白欣立 徐 飞 简 朔 李 鑫 赵子春 高爱民 薛 峰摘要 目的 克隆空肠弯曲菌 penner o: 19 c jaA基因, 构建其原核表达载体, 诱导表达及纯化蛋白,为基因工程疫苗的研制打下基础。方法 扩增空肠弯曲菌 penner o: 19 c jaA基因, 构建 pGEM T cjaA克隆载体,以 EcoR I和 Xho I为酶切位点构建 pGEX 4T 1 c jaA原核表达载体。表达载体转化 E. co li BL21后诱导表达,SDS PAGE鉴定表达产物, 用 G luta th ione Sepharo se4B纯化重组蛋白。结果 成功构建 pGEX 4T 1 c jaA表达载体, 并获得浓度为 10 g / l的 rGST C jaA重组蛋白。结论 成功构建 pGEM T cjaA克隆载体及 pGEX 4T 1cjaA表达载体,获得重组蛋白 rGST C jaA, 为研究空肠弯曲菌疫苗打下基础。关键词 空肠弯曲菌; c jaA基因; 原核表达;载体构建; 蛋白纯化中图分类号: R37 文献标识码: A 文章编号: 1006 351X ( 2011) 02 0081 04Construc tion of the prokaryotic express vector of c jaA gene of campy lobacter jejun i X ING Cong cong,LI Zhen zhong, BA I X i n li, XU Fei, J IAN Shuo, LI X i n, ZHAO Z i chun, GAO A i m i n, XUE F eng. Depa rtm en t o fNeuro logy, the Second H osp ital o fH ebe iM ed ica lUn iversity, Shija zhuang 050000, Ch ina.Correspond ing au thor: L I Zhen zhong, Em a i:l Johndocter@ vip. 163. comAbstract Objective To construc t prokaryo tic expression vec to r carry ing campylobacter. je juni penner o: 19cjaA gene, express it in E. co li and pur ify prote in . M ethods The c jaA gene w ere am plified by PCR. The c lonevec to r pGEM T and expression vec to r pGEX 4T 1 w ith inserted c jaA gene w ere constructed. The targ et prote in wasexpressed in E. co li BL21. The pro te in w as identified and analyzed by SDS PAGE. The targe t pro tein w as purified byG lu tath ione Sepharose4B. Resu lts Constructed the expression vector pGEX 4T 1 cjaA, pur ified the recomb inantprote in. Conclusion The recom binant plam id pGEM T cjaA and pGEX 4T 1 c jaA have been successfu llyconstructed and the GST C jaA pro tein is purified , w hich lays the founda tion for the further development o f C. je jun igenetic eng ineer ing vaccine.Keywords Cam py lobacter je jun;i C jaA gene; Prokaryotic expression; Vecto r construction; Pur ify prote in.基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30471919) ;国家高技术研究发展计划 ( 2006AA02A208 ); ( 863计划 2006AA02A2080)作者单位: 050000石家庄, 河北医科大学第二医院神经内科 (邢丛丛、李震中、李鑫、赵子春、高爱民 ) ,儿科 (白欣立 ) ; 江苏出入境检疫局动植物与食品检测中心 (徐飞、薛峰 ) ;厦门大学医学院 (简朔 )通信作者:李震中, Em ai:l Johndocter@ vip. 163. com空肠弯曲菌 ( campy lobacter je jun,i C j)通过食源性或水源污染导致人畜腹泻、肠炎,是世界范围内导致人畜腹泻、肠炎的主要病原菌。空肠弯曲菌感染后自身免疫反应高度相关急性运动性轴索型吉兰 巴雷综合征 ( acute motor axonal neuropathy, AMAN ),并在动物模型中得到了证实[ 1]。预防细菌污染食物、水源及减少人畜空肠弯曲菌的感染率是降低空肠弯曲菌相关疾病发病率的措施之一。微生物外膜分子刺激机体免疫反应, 记忆 T细胞及保护性抗体可以抵御外源细菌的增殖、侵袭。 c jaA基因是保守性基因, C jaA的 C末端氨基酸绑定于内膜, 部分氨基酸暴露于外膜,是 ABC型半胱氨酸转运系统成分之一,半胱氨酸在空肠弯曲菌的生理代谢中尤为重要, C jaA具有高免疫原性,是细菌外膜抗原及疫苗候选成分之一。本实验以空肠弯曲菌 penner o: 19基因组为模板克隆表达 cjaA基因,纯化后重组蛋白免疫机体产生抗体既可抵御空肠弯曲菌的感染亦能特异性抵御空肠弯曲菌 penner o: 19的感染,减少空肠弯曲菌的感染率及AMAN的发病率。材料和方法一、材料空肠弯曲菌 penner o: 19由本实验室保存。E. co li菌 DH5、BL21和质粒 PGEX 4T 1由清华大学医学院常智杰教授惠赠。Taq DNA po lym erase, pyrobest DAN81脑与神经疾病杂志 2011年第 19卷第 2期po lymerase, dNTP, T4DNA 连接酶, 限制性内切酶( E coR I和 XhoI) , DNA M arker,低分子量蛋白 Marker,购自 Takara公司; pGEM T K it购自 Promega公司,DNA凝胶回收与纯化试剂盒, 高纯度质粒小量提取试剂盒购自威格拉斯公司; IPTG,考马斯亮蓝 R 250购自S igma公司; G lutath ione Sepharose4B购自 GE公司。二、方法1. 获取基因组 DNA: 将空肠弯曲菌 penner o: 19接种于 CM0739培养基,置于含 10% CO2, 5% O2的微需氧环境中, 37 培养 48m in, 采用 DNA抽提试剂盒提取 C. je jun i penner o: 19基因组 DNA,采样分光光度计测其浓度 180ng /u l。2. 扩增 cjaA 基 因: 参 考 Genebank (编 号 NZAASL01000001)报道 cjaA序列,在其上下游设计引物,引物序列如下, P for: AGAGCTAGAATTTCCTCCACAAGA;Prev: ATTTAGAGCAAAGAATTTAATCTTGC。PCR反应条件为 94 预变性 5m in, 94 变性 30秒, 53 退火 30秒,72 延伸 1m in, 30个循环, 72 延伸 10m in, 4 保存。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR产物,用 DNA凝胶回收纯化试剂盒回收纯化 PCR产物。3. 构建 pGEM T c jaA重组质粒:将纯化的 cjaA和pGEM T按 4: 1摩尔比室温连接 1h, 转化 E. co liDH 5感受态细胞,用带有氨苄霉素的 LB培养基筛选重组质粒 pGEM 4T 1 cjaA阳性克隆,用 EcoR I酶切鉴定重组质粒并送 inv itrogen公司测序鉴定。4.构建 pGEX 4T 1 c jaA重组质粒: 以阳性克隆质粒 pGEM 4T 1 c jaA为模板, 以 c jaA CDS为目的序列,以 EcoR I和 XhoI为酶切位点设计引物,引物序列如下,P for: cgagaattcATGAAAAAAATACTTCTAAG; Prev:tatctcgagAATTTTTCCACCTTCAATC。扩增 c jaA基因并回收纯化,用 EcoR I和 Xho I双酶切 c jaA和 pGEX 4T 1,回收纯化 c jaA和 pGEX 4T 1并按 4: 1摩尔比 16 连接3h,转化 E. co li DH5 感受态细胞, 用带有氨苄霉素的LB培养基筛选重组质粒 pGEX 4T 1 cjaA阳性克隆,用EcoRI和 XhoI双酶切鉴定重组质粒并送 inv itrogen公司测序鉴定。5. 重组质粒诱导表达及表达形式的分析: 将阳性克隆重组质粒 pGEX 4T 1 c jaA转化 E. co liBL21,接种阳性克隆于带有氨苄霉素的 LB培养基 37 220转 /分过夜增菌, 按 1: 100转接菌液于 30 150转 /分增菌至 A600= 0. 4, 用终浓度 0. 1mmo l /L的 IPTG诱导培养4h,离心收集菌体,用 PBS重悬菌体,冰浴超声破碎细菌至悬液清亮, 分离全菌, 上清, 沉淀, 用 10%分离胶进行 SDS PAGE电泳, 用考马斯亮蓝 R 250染液染色和脱色液脱色后观察重组蛋白表达形式。6. 重组蛋白纯化: 于 4 8000转 /分离心 15m in收集诱导培养 200m l菌体, 用 PBS重悬菌体, 冰浴超声破碎细菌 30m in,收集超声碎菌后的上清液,用活化的 G lutath ione Sepharose4B结合重组蛋白, 用 PH8. 8,20mMGSH 洗脱液洗脱重组蛋白, 将纯化蛋白进行SDS PAGE电泳,用考马斯亮蓝 R 250染液染色和脱色液脱色后分析重组蛋白的纯化结果。结 果1. c jaA基因扩增结果 (图 1)M: DNA ladder; 1 ~ 2: cjaA基因扩增条带图 1 cjaA基因 PCR扩增以空肠弯曲菌基因组 DNA为模板进行 PCR扩增。PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳分析。电泳结果显示 PCR扩增产物为单一条带,大小位于 1. 4Kbp处。2. 重组质粒 pGEM T c jaA酶切及测序结果 (图 2)M: DNA marker; 1~ 10: pGEM T cjaA用 E coR I酶切图 2 重组质粒 PGEM T cjaA单酶切琼脂糖凝胶鉴定重组质粒 pGEM T c jaA用 EcoR I酶切后得到大小位于 1. 4Kbp的插入片段,说明 c jaA已经成功插入到 pGEM T的多克隆位点。以 pGEM T通用引物双向测序插入基因 cjaA, 用DNASTAR比对测序结果确定 penner o: 19 cjaA CDS序列。3.重组质粒 pGEX 4T 1 cjaA酶切及测序结果 (图 3)82 脑与神经疾病杂志 2011年第 19卷第 2期M: M arker; 1~ 3: pGEX 4T 1 cjaA用 EcoRI和 Xhol双酶切图 3重组质粒 pGEX 4T 1 cjaA双酶切琼脂糖凝胶鉴定重组质粒 pGEX 4T 1 c jaA用 EcoR I和 XhoI双酶切得到大小位于 840bp的插入片段, 说明 cjaA CDS序列已经成功插入到 pGEX 4T 1的多克隆位点。以 pGEX 4T 1通用引物双向测序插入基因 cjaA,用 DNASTAR比对结果确定测序正确质粒。4. 重组质粒的诱导表达及表达形式分析 (图 4)M:低分子量蛋白 M arker; 1:诱导后全菌; 2:诱导后上清; 3:诱导后沉淀图 4 重组蛋白 rGST C jaA诱导表达及表达形式 SDS PAGE鉴定阳性克隆重组质粒 pGEX 4T 1 c jaA转化 E. co liBL21,于 30 150rpm /m in用终浓度为 0. 1mmo l/L的IPTG诱导培养 4h, 分离全菌, 上清, 沉淀, 通过 SDSPAGE考马斯亮蓝染色分析 58KD处有特异性重组蛋白条带 (图 3), 因为质粒 pGEX 4T 1在多克隆位点上游有一段 GST编码序列 (分子量约为 28KD)与 C jaA(分子量约为 30KD )蛋白融合表达, 所以重组蛋白的分子量与预计理论值是相符的。5. 重组蛋白纯化结果 (图 5)M:低分子量蛋白 M arker; 1:未诱导; 2:诱导后全菌; 3:诱导后上清; 4:诱导后沉淀; 5:洗脱蛋白 1; 6:洗脱蛋白 2图 5 重组蛋白 rGST CJAA表达及纯化 SDS PAGE鉴定收集诱导培养菌体,冰浴超声破碎细菌 30m in, 收集超声碎 菌后的上 清液, 用 活化的 G lutath ioneSepharose4B结合重组蛋白, 用 PH 8. 8, 20mM GSH的洗脱液洗脱重组蛋白, 用 10%的分离胶进行 SDS PAGE电泳,用 R 250染液染色和脱色液脱色后分析重组蛋白的纯化结果。讨 论空肠弯曲菌是发现于动物肠道内的革兰氏阴性菌,呈弯曲的杆状。对鸡, 火鸡和牛的研究表明, 一群家禽或一栏家畜有高达 50% ~ 100%的个体携带空肠弯曲菌。从表层水中也可分离出大量的空肠弯曲菌。他通过污染的水和食物,接触感染的动物或口肛性行为传染给人,全球每年约有 50亿人口的感染率[ 2]。发达国家空肠弯曲菌性肠炎的暴发流行多是因为污染的水源、牛奶及进食烹饪不当的食物。1972年于腹泻病人的大便标本中分离空肠弯曲菌,目前的研究未能完全揭示空肠弯曲菌的毒力及致病机制,较少的研究说明空肠弯曲菌感染后多变的免疫反应[ 3]。空肠弯曲菌的感染导致禽畜及人群的弯曲菌性肠道疾病及感染后免疫反应相关疾病, 抵御细菌的感染及其暴发流行是公共卫生的任务之一。自1921年 Monsieur传代培育获得减毒结核杆菌疫苗( BCG )以来, 疫苗的研究应用在抵御了病原微生物的感染中起重要作用。传统的疫苗包括减毒活疫苗和灭火疫苗,新型疫苗以基因疫苗为主。亚单位疫苗需要选择合适的保护性抗原及将其呈递给免疫系统的途径,至今鞭毛蛋白及外膜蛋白被认为是候选亚单位疫苗[ 4]。革兰氏阴性细菌的极性氨基酸大多锚定于核周质,革兰氏阳性细菌的极性氨基酸大多锚定于细胞膜上,而空肠弯曲菌的 C jaA锚定于外膜上, 是其具有免疫原性的因素之一。 2008年83脑与神经疾病杂志 2011年第 19卷第 2期S tuart等[ 5]应用互补蛋白质组学技术验证了 C jaA是膜相关蛋白,且能被兔抗空肠弯曲菌血清识别[ 6]。C jaA ( C j0982c: 30kDa)和 C jaC ( C j0734c: 28kD a)与原核生物的 ABC转运系统具有同源性, C jaA具有高免疫原性及不同血清型菌株间具有高度保守性, 且C jaA与 C jaC具有结构同源性, 使得 C jaA成为极有价值的疫苗候选抗原。在 Agn ieszka等[ 7]的实验中给予鸡载有 C jaA蛋白的减毒沙门菌疫苗口服免疫, 可刺激机体产生空肠弯曲菌特异性 IgG抗体及肠道分泌性IgA抗体,在安全性实验中能抵御空肠弯曲菌的感染。C jaA是空肠弯曲菌疫苗候选抗原之一, 本实验以分子克隆技术得到了空肠弯曲菌 C jaA的融合蛋白, 为亚单位疫苗的进一步开发研制打下基础,降低禽畜类及人群的空肠弯曲菌感染率, 减少腹泻及感染后免疫相关疾病的发生率。参 考 文 献[ 1 ] 李春岩,薛平,刘瑞春,等.空肠弯曲菌致鸡格林巴利综合征动物模型的初步研究.脑与神经疾病杂志, 1994; 2: 68 69.[ 2 ] Tam CC, O B' rin SJ, Adak Gk, et a.l Cam pylobaecter species: don t' puta ll you r eggs in one ch icken. 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CurrM icrob io,l 2008, 57: 181 188.[ 7 ] Wyszynsk a A, Raczko A, LisM, et a.l Oral imm un ization of ch ickensw ith aviru len t Salm on ella vaccine s train carrying C. jejun i 72D z /92cjaA gene elicits sp ecific hum oral imm un e response associated w ithp rotection aga inst ch allenge w ith w ild type campy lobacter . Vaccine,2004, 22: 1379 1389.( 2010 04 28收稿 )论 著110例脑梗死患者的全脑数字减影血管造影的临床研究王 松摘要 目的 探讨脑梗死患者与颅内 颅外段动脉狭窄或闭塞的关系及其临床意义。方法 选择符合脑梗死诊断标准的 110例患者行全脑数字减影血管造影 ( DSA )检查, 对颈内动脉系统脑梗死 ( ICA CI)和椎 基动脉系统脑梗死 ( VB CI)患者的颅内 颅外段动脉狭窄或闭塞进行分析比较。结果 110例脑梗死患者中 85例( 77. 27% )有动脉狭窄或闭塞。其中 25例 ( 22. 73% )为单纯颅外段动脉狭窄或闭塞, 41例 ( 37. 27% )为单纯颅内段动脉狭窄或闭塞, 19例 ( 17. 27% )为颅内 颅外段动脉多发性狭窄或闭塞。DSA共检出动脉狭窄或闭塞 173支,颅外动脉段狭窄或闭塞 65支 ( 37. 57% ), 颅内段动脉狭窄或闭塞 108支 ( 62. 43% )。颅内段动脉狭窄或闭塞发生率 ( 62. 43% )明显高于颅外段动脉 ( 37. 57% )。颅外段动脉狭窄或闭塞的好发部位依次为: 颈内动脉颅外段 26支 ( 15. 03% ),椎动脉颅外段 19支 ( 10. 98% ),颈总动脉 14支 ( 8. 09% ), 锁骨下动脉 6支 ( 3. 47% )。颅内段动脉狭窄或闭塞的好发部位依次为:大脑中动脉 37支 ( 21. 39% ),颈内动脉颅内段 25支 ( 14. 45% ),椎动脉颅内段 18支 ( 10. 40% ),大脑后动脉 11支 ( 6. 36% ),大脑前动脉 9支 ( 5. 20% ),基底动脉 8支 ( 4. 62% )。 ICA CI组单纯颅外段动脉狭窄或闭塞高于 VB C I组 (P < 0. 05), ICA C I组单纯颅内段动脉狭窄或闭塞高于 VB C I组(P < 0. 01), ICA C I组颅内 颅外段动脉多发狭窄或闭塞低于 VB CI组 (P < 0. 05)。 ICA C I组单纯颅内段动脉狭窄或闭塞高于单纯颅外段动脉窄或闭塞, VB CI组单纯颅内动脉段狭窄或闭塞高于单纯颅外动脉段狭窄或闭塞 ( P< 0. 05)。动脉狭窄及粥样硬化斑块与年龄、高血压、低血压、糖尿病、高甘油三酯 ( TG )、高总胆固醇 (TC)、高基金项目:菏泽市立医院科研基金资助项目 ( Y2008SN01)作者单位: 274000山东,菏泽市立医院神经内科84 脑与神经疾病杂志 2011年第 19卷第 2期

空肠弯曲菌penner o:19 cjaA基因的克隆表达

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/18377/%e7%a9%ba%e8%82%a0%e5%bc%af%e6%9b%b2%e8%8f%8cpenner_o_19_cjaA%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e7%9a%84%e5%85%8b%e9%9a%86%e8%a1%a8%e8%be%be.pdf?sequence=1&isAllowed=y

空肠弯曲菌penner o:19 cjaA基因的克隆表达

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