目的比较2种国产戊型肝炎IgG抗体诊断试剂(E2-IgG和X-IgG)的特异性与敏感度。方法利用2种试剂对2006年江苏省某市普通人群的流行病调查血清标本460份和经过巢式逆转录聚合酶链式反应(nest-RT-PCR)鉴定为HEV核酸阳性的临床戊型肝炎患者血清标本72份进行平行检测,并以免疫印迹实验(Westernblot,WB)和中和单抗阻断试验进行验证。结果1.460份流行病调查血清标本中WB阳性188份。2.188份WB阳性标本中E2-IgG的检测敏感度为99.5,特异度为99.6,阳性预测值99.5,阴性预测值99.6,准确性99.6;X-IgG的检测敏感度为21.3,特异度为97.4,阳性预测值85.1,阴性预测值64.1,准确性66.3。3.E2-IgG阴、阳性A450/A620值的分布在临界值附近分界明显,小于临界值的A450/A620值取对数后呈正态分布,而阳性血清A450/A620值的高低与其WB的反应强度正相关。4.E2-IgG阳性、X-IgG阴性的血清共148份,中和单抗阻断阳性率为98,WB阳性率99.3。5.经PCR鉴定为HEV核酸阳性的急性戊型肝炎患者血清中E2-IgG敏感度98.6,X-IgG敏感度80.6(χ2=10.7,P<0.01)。结论E2-IgG在不同人群中均能较好的反映体内戊型肝炎抗体存在的真实情况

夏宁邵

张军

杜海莲

江浪

王颖彬

葛胜祥

闫强

黄守杰

Xiamen University Institutional Repository

2008 , 24 (12) 中 国 人 兽 共 患 病 学 报Chinese Journal of Zoonoses文章编号 :1002 - 2694 (2008) 12 - 1087 - 03两种戊型肝炎 IgG抗体检测试剂的比较闫 　强 ,杜海莲 ,王颖彬 ,葛胜祥 ,黄守杰 ,江 　浪 ,张 　军 ,夏宁邵摘 　要 :目的 　比较 2 种国产戊型肝炎 Ig G抗体诊断试剂 ( E22Ig G 和 X2Ig G) 的特异性与敏感度。方法 　利用 2 种试剂对 2006 年江苏省某市普通人群的流行病调查血清标本 460 份和经过巢式逆转录聚合酶链式反应 ( nest2RT2PCR) 鉴定为H EV 核酸阳性的临床戊型肝炎患者血清标本 72 份进行平行检测 ,并以免疫印迹实验 (Western blot ,WB)和中和单抗阻断试验进行验证。结果 　1. 460 份流行病调查血清标本中 WB 阳性 188 份。2. 188 份 WB 阳性标本中 E22Ig G的检测敏感度为99. 5 % ,特异度为 99. 6 % ,阳性预测值 99. 5 % ,阴性预测值 99. 6 % ,准确性 99. 6 % ; X2Ig G的检测敏感度为 21. 3 % ,特异度为97. 4 % ,阳性预测值 85. 1 % ,阴性预测值 64. 1 % ,准确性 66. 3 %。3. E22Ig G阴、阳性 A450 / A620值的分布在临界值附近分界明显 ,小于临界值的 A 450 / A620值取对数后呈正态分布 ,而阳性血清 A 450 / A620值的高低与其 WB 的反应强度正相关。4. E22Ig G阳性、X2Ig G阴性的血清共 148 份 ,中和单抗阻断阳性率为 98 % ,WB 阳性率 99. 3 %。5. 经 PCR 鉴定为 H EV 核酸阳性的急性戊型肝炎患者血清中 E22Ig G敏感度 98. 6 % ,X2Ig G敏感度 80. 6 %(χ2 = 10. 7 , P < 0. 01) 。结论 　E22Ig G在不同人群中均能较好的反映体内戊型肝炎抗体存在的真实情况。关键词 :戊型肝炎 , Ig G;诊断试剂 ;免疫印迹 ;中和单抗　　中图分类号 :R373 　文献标识码 :A 　　Comparison of two diagnostic reagents to detect anti2hepatitis E virus IgGantibodiesYAN Qiang ,DU Hai2lian ,WAN G Ying2bin , GE Sheng2xiang ,HUAN G Shou2jie ,J IAN G Lang ,ZHAN G J un ,XIA Ning2shao( N ational Institute of Diagnostics and V accine Development in Inf ectious Disease , Xiamen University , Xiamen 361005 , China)ABSTRACT :The sensitivity and specificity of two diagnostic reagent to detect the presence of anti2hepatitis E virus Ig G an2tibodies ( E22Ig G and X2Ig G) were tested in 460 serum samples taken f rom population undergoing an epidemiological investiga2tion of Jiangsu province in 2006 and 72 serum samples taken f rom patient s with hepatitis E virus ( H EV) infection identified bynest RT2PCR , and the result s were also confirmed with Western blot assay and the blocking test with neutralizing monoclonalantibody (mAb) . It was found that the sensitivity , specificity , positive or negative prediction values as well as accuracy of E2were 99. 5 % , 99. 6 % , 99. 5 % , 99. 6 % and 99. 6 % ; while those of X2Ig G were 21. 3 % , 97. 4 % , 85. 1 % , 64. 1 % and 66. 3 %respectively. The positive and negative A450 / A620 values of E22Ig G were distinct around the cut2off value , and the log value ofthe A450 / A620 smaller than the cut2off value showed a pattern of normal dist ribution , while the A450 / A620 value of the positive se2rum correlated with the intensity of Western blot assay. In addition , the positive rates of 148 samples of positive E22Ig G butnegative X2Ig G as demonst rated by neutralizing mAb blocking test and Western blot assay were 98. 0 % and 99. 3 % , and thesensitivities of E22Ig G and X2Ig G tested in serum samples of patient s with acute H EV infection with positive H EV nucleic acidas demonst rated by PCR were 98. 6 % and 80. 6 % respectively (χ2 = 10. 7 , P < 0. 01) . It is apparent that the diagnostic reagentE22Ig G in comparison with X2Ig G , can reflect a better performance on the real condition of H EV Ig G antibodies in differentgroups of populations.　　KEY WORDS : hepatitis E ; Ig G;diagnositic reagent s ;Western blotting ;neutralizing antibody　　　　通讯作者 :夏宁邵 , Email : nsxia @xmu. edu. cn　　作者单位 :厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 ,厦门　361005　　目前 ,抗戊型肝炎病毒 ( H EV) Ig G检测试剂主要有两类 ,一类为以线性表位为基础的传统试剂 ,包括新加坡 Genelabs 公司和国内大部分公司提供的戊肝抗体检测试剂 ;一类为以 H EV ORF2 构象依赖性免疫优势表位为基础的新型诊断试剂。传统H EV Ig G检测试剂由于未采用 H EV 的免疫优势表位 ,对抗 H EV Ig G抗体的免疫应答不强 ,且在患7801中 国 人 兽 共 患 病 学 报Chinese Journal of Zoonoses 2008 , 24(12)者感染急性期后会明显减弱或消失〔1〕。以 H EVORF2 构象依赖性免疫优势表位为抗 H EV 体液免疫应答的主要表位 ,不仅对抗 H EV Ig G 抗体的应答强 ,且能在患者体内长时间高滴度存在〔2〕。我们利用大肠杆菌表达的 N E2〔3〕中的二个构象依赖性表位〔4〕 ,成功建立了抗 H EV Ig G的 EL ISA 检测试剂 ( E22Ig G) 。大量的动物实验与临床标本检测显示 E22Ig G 较传统的抗 H EV2Ig G 试剂有明显较高的阳性率 ,能更好地反映体内戊型肝炎抗体的水平〔528〕 ,但是其特异性一直未得到比较中肯的评价。目前 H EV 病毒尚无法大量培养 ,也无法利用 H EV全病毒抗原进行 WB 检测 ,基于重组抗原的 WB 方法进行戊肝 Ig G抗体的确认是被认可的〔9〕 ,本研究用 E22Ig G与一种传统戊型肝炎抗体检测试剂 ( X2Ig G)平行检测 460 份中经 WB 确证的 188 份普通人群标本 ,并用中和单抗阻断实验进一步验证其特异性 ;同时平行检测 72 份 H EV 核酸阳性的临床戊型肝炎患者血清 ,进一步比较这两种试剂的敏感度和特异性。1 　材料与方法1. 1 　标本来源 　选取 2006 年江苏省东台市普通人群的流行病调查标本中的随机样本 460 份 ,另外选取 H EV 核酸阳性的急性戊型肝炎的血清标本 72 份 ,均 - 20 ℃冻存。1. 2 　诊断试剂 　国内一家诊断公司生产的抗 H EV Ig G试剂 (X2Ig G ,批号 20061023)和北京万泰生物药业有限公司生产的抗 H EV Ig G试剂 ( E22Ig G ,批号 EG20061101) 。以上试剂操作及结果判定严格按照各自说明书进行。1. 3 　重组抗原和单克隆抗体 　重组抗原 P239 为大肠杆菌表达的 H EV ORF2 aa3682606 ,在体外可形成类病毒颗粒 ,具有较强的构象型表位 ,与戊型肝炎患者恢复期血清反应性良好 ,动物实验证实具有较好的免疫原性和免疫保护性〔10〕。阻断实验用 H EV 中和单抗 8C11 和 8 H3 由 N E2 抗原制备〔11〕。1. 4 　H EV RNA 检测 　采用 nest2RT2PCR 对所选标本进行 H EV 核酸检测〔12〕,引物由上海英骏生物技术有限公司合成。1. 5 　WB 检测 重组抗原 P239 经 12 %的十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS2PA GE) 后转移到硝酸纤维膜进行杂交 ;用 5 %脱脂奶封闭 2 h ,加待检血清 4 ℃反应过夜 ;用 TN T 洗膜 3 次 ,每次 10 min ;加羊抗人碱性磷酸酶反应 1h ;用 TN T 洗膜 3 次 ,每次 10 min ;NB T 和 BCIP 显色。1. 6 　抗 H EV mAb 对待检血清的阻断实验 对待检血清标本进行单克隆抗体阻断试验〔5〕,以未阻断孔 A450 / A620 值在0. 8～1. 5 之间的稀释度计算阻断率 ,阻断率 = (1 - 阻断孔A/ 未阻断孔 A) ×100 % ,阻断率 > 50 %为阻断阳性。1. 7 　统计学分析 以 WB 检测为金标准 ,计算 E22Ig G和 X2Ig G的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确性。2 　结 　果2. 1 　WB 检测结果 　使用重组抗原 P239 对 460 份一般人群血清进行 WB 检测 ,结果确定阳性标本188 份 ,占 40. 9 % ;阴性标本 272 份 ,占 59. 1 %。对460 份标本 WB 的反应强度进行分级 ,见图 1 ,其中阴性 ( - ) 272 份 ,弱阳性 ( + ) 80 份 ,阳性 ( + + ) 51份 ,强阳性 ( + + + ) 57 份。图 1 　免疫印迹试验反应强度分级Fig. 1 　The response intensity of Western Blotting test2. 2 　两种试剂在普通人群中的平行比较 　见表 1 ,在上述 188 份 WB 检测阳性的标本中 , E22Ig G检出187 份 ,X2Ig G检出 40 份 ;在 272 份 WB 检测阴性的标本中 ,E22Ig G阴性为 271 份 ,X2Ig G阴性为 265份。在 460 份总体样本的检测中 , E22Ig G 检出 188份 , X2Ig G检出 47 份。E22Ig G阴阳性 A 450 / A 620 值的分布在临界值附近分界明显 ,见图 2 ,小于临界值的 A 450 / A 620值取对数后呈正态分布 ( A450 / A 620 值的几何平均值为 0. 009) ,而阳性血清 A 450 / A 620值的高低与其 WB 的反应强度正相关 ,见图 3。表 1 　E22IgG和 X2IgG检测能力的评价Table 1 　The detective ability evaluation of E22IgGand X2IgG检测方法WB 实验+ -合 　　计E22Ig G+ 187 1 188- 1 271 272X2Ig G+ 40 7 47- 148 265 413　　根据表 1 计算 , 得出 E22Ig G 检测敏感度99. 5 % ,特异度 99. 6 % ,阳性预测值 99. 5 % ,阴性预测值 99. 6 % ,准确性 99. 6 %。X2Ig G 检测敏感度21. 3 % ,特异度 97. 4 % ,阳性预测值 85. 1 % ,阴性预测值 64. 1 % ,准确性 66. 3 %。88012008 , 24 (12) 中 国 人 兽 共 患 病 学 报Chinese Journal of Zoonoses2. 3 　中和单抗阻断试验 　为了进一步验证 E22Ig G的特异性 ,对上述 148 份中 E22Ig G 阳性而 X2Ig G阴性的标本利用中和单抗 8C11 和 8 H3 进行阻断 ,其中 145 份阻断率大于 50 % ,阻断率从 51 %到98. 8 %不等 ,平均 (75. 5 ±1. 9) % ,成功阻断率为98. 0 % ,在上述 148 份标本中 WB 阳性 147 份 ,阳性率 99. 3 %。(χ2 = 0. 021 , P > 0. 05) ,经卡方检验提示中和单抗阻断实验和 WB 实验对上述 148 份阳性标本的检验结果没有差异。2. 4 　两种试剂对急性戊型肝炎血清标本的检出情况 :利用两种试剂平行检测 72 份经 nest2R T2PCR鉴定为 H EV 核酸阳性的急性肝炎血清标本 , E22Ig G检出 71 份 ,X2Ig G检出 58 份 ,对二者的 s/ co 比较发现 , E22Ig G的 s/ co 较高 ,且阴阳性反应的分界比较明显 ,见图 4。3 　讨 　论　　本研究表明不论在普通人群或急性戊型肝炎患图 4 　HEV核酸阳性标本中两种试剂的比较Fig. 4 　Comparison of E22IgGand X2IgG in serum samples ofHEV RNA positive者中 ,基于构象型免疫优势表位的戊型肝炎抗体检测试剂 ( E22Ig G) 可以更真实地反映机体内抗戊型肝炎抗体存在的情况 ,更适用于戊肝的血清流行病学调查。在 72 份 H EV RNA 阳性的急性戊型肝炎临床标本中 ,E22Ig G检出 71 份 ,X2Ig G检出 58 份。在 272 份 WB 阴性的普通人群标本中 , E22Ig G的特异性 (99. 6 %) 要稍好 X2Ig G(97. 4 %) ,但差异无统计学意义 ;而在 WB 阳性的 188 份标本中 , E22Ig G敏感度 ( 99. 5 %) 明显高于 X2Ig G ( 21. 3 % , P <0. 05) 。　　已有的研究表明 E22Ig G在普通人群中有较高的阳性率〔627〕 ,但其特异性一直未得到很好的验证。此次研究的 460 份普通人群标本中 , E22Ig G 阳性148 ,阳性率为 40. 9 % ,高于 X2Ig G的 10. 2 %。在这148 份样本中 ,147 份为 WB 阳性 ,145 份能被中和单抗成功阻断 ,证实了 E22Ig G 较传统试剂有更高的检出率是由于其拥有更高的灵敏度 ,而不是假阳性造成的。　　抗体检测试剂所用的抗原直接影响试剂的品质 ,包括特异度和敏感度。传统抗戊型肝炎抗体检测试剂包被用抗原为合成多肽或/ 和重组抗原〔13〕 ,由于不具 H EV 的免疫优势表位 , H EV 感染后机体相应抗体的阳转率不高 ,反应性不强 ,在感染后容易消退〔1〕。此外 ,由于 H EV 的非免疫优势表位在不同的基因型间存在差异 ,因此不同的传统试剂在检测人群戊肝抗体时相互间差异较大 ,准确性低〔14〕。基于可形成构象依赖性表位的重组抗原 N E2 进行商品化生产的新型抗戊型肝炎抗体检测试剂 E22Ig G在普通人群和临床急性戊型肝炎标本中都有较高的检出率和较低的假阳性率。因此 ,新型抗戊型肝炎抗体检测试剂较传统抗 H EV2Ig G试剂在人群流行病学调查时可更好估计戊型肝炎的流行情况。(转第 1099 页)98012008 , 24 (12) 中 国 人 兽 共 患 病 学 报Chinese Journal of Zoonosesjor outer membrane protein〔J〕. 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两种戊型肝炎IgG抗体检测试剂的比较

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21196/%e4%b8%a4%e7%a7%8d%e6%88%8a%e5%9e%8b%e8%82%9d%e7%82%8eIgG%e6%8a%97%e4%bd%93%e6%a3%80%e6%b5%8b%e8%af%95%e5%89%82%e7%9a%84%e6%af%94%e8%be%83.pdf?sequence=1&isAllowed=y

两种戊型肝炎IgG抗体检测试剂的比较

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