用Tris-HCl缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀,DEAE-纤维素和葡聚糖凝胶层析,从草鱼肠中提取出碱性磷酸酶(ALP).提取倍数为6.74,比活为684 U/mg蛋白.酶液经PAGE呈现单一带,该酶催化对硝基苯磷酸二钠(pNPP)水解反应的最适pH值为10.41,最适温度为27℃,Km值为1.01 mmol/L,酶的热稳定性与pH稳定性研究表明:该酶在pH 6.6~11.5区间和在温度低于45℃下稳定.研究金属离子对酶活力影响的结果表明:一价金属离子Li+、Na+和K+对酶活力没有影响;二价金属离子Mg2+、Mn2+和Co2+对酶有不同程度的激活作用;Zn2+对酶有抑制作用

张继平

林建成

谢进金

陈清西

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第 44 卷 　第 5 期 厦门大学学报 (自然科学版) Vol. 44 　No. 5　2005 年 9 月 Journal of Xiamen University (Nat ural Science) Sep . 2005 　草鱼碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质研究　　收稿日期 :2004208218基金项目 :教育部跨世纪人才经费和厦门大学科技创新工程基金( XD KJ CX20043001)作者简介 :张继平 (1972 - ) ,男 ,博士研究生. 现工作单位 :广东佛山科学技术学院动物科学系.3 通讯作者 :chenqx @jingxian. xmu. edu. cn张继平 ,林建成 ,谢进金 ,陈清西 3(厦门大学生命科学学院 ,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 ,福建 厦门 361005)摘要 : 用 Tris2HCl 缓冲液抽提 ,硫酸铵分级沉淀 ,DEA E2纤维素和葡聚糖凝胶层析 ,从草鱼肠中提取出碱性磷酸酶(AL P) . 提取倍数为 6. 74 ,比活为 684 U/ mg 蛋白. 酶液经 PA GE 呈现单一带 ,该酶催化对硝基苯磷酸二钠 (pNPP)水解反应的最适 p H 值为 10. 41 ,最适温度为 27 ℃, Km 值为 1. 01 mmol/ L ,酶的热稳定性与 p H 稳定性研究表明 :该酶在 p H 6. 6～11. 5 区间和在温度低于 45 ℃下稳定. 研究金属离子对酶活力影响的结果表明 :一价金属离子 Li + 、Na + 和 K+ 对酶活力没有影响 ;二价金属离子 Mg2 + 、Mn2 + 和 Co2 + 对酶有不同程度的激活作用 ;Zn2 + 对酶有抑制作用.关键词 : 草鱼 ;碱性磷酸酶 ;分离纯化 ;温度 ;p H ;金属离子中图分类号 : Q 356. 1 　　　　　文献标识码 :A 　　　　　文章编号 :043820479 (2005) 0520684204　　碱性磷酸酶 (Alkaline p hosp hatase , EC 3. 1. 3. 1 ,简称 AL P)广泛存在于动物、植物及微生物体内 ,是一种膜结合蛋白 ,在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程 ,对体内钙磷的吸收与代谢、维持体内适宜的钙磷比例起重要作用[ 1 ] . 目前国内外学者已对多种贝类及几种鱼类的 AL P 进行了研究[2～4 ] ,但对无胃鱼类草鱼的研究未见报道. 草鱼是我国的淡水养殖主养鱼类 ,由于草鱼的养殖大都以投喂配合饲料为主 ,其排泄物较高含量的磷对水体造成较大的污染 ,不利于养殖业的可持续发展. 本研究以草鱼为试验材料 ,分离纯化了 AL P ,研究其酶学性质与活力影响因素 ,旨在探讨该酶活力调控机理 ,为草鱼配合饲料的改良、加强磷的吸收和减少磷的污染提供理论指导.1 　材料与方法1 . 1 　材料与试剂草鱼 ( Ctenop hary ngodon i del l us) 购自厦门白城水产市场. 对2硝基苯磷酸二钠 (pN PP) 为 E. Merck 产品 ;二乙基氨基乙基纤维素 (DEA E232) 为 What man产品 ;葡聚糖凝胶 ( Sep hadex G2150) 为 Pharmacia 产品 ;甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 为 Fluka 产品 ;丙烯酰胺(Acr)等为上海试剂一厂产品 ;其余化学试剂均为国产分析纯.1 . 2 　试验方法1. 2. 1 酶的分离纯化参照文献[ 1 ]的方法 ,适当修改. 用草鱼肠为提取酶的材料 ,用冷蒸馏水漂洗后 ,按 1 ¬1 加入 0. 01 mol/L Tris2HCl 缓冲液 (p H 7. 5 ,含 0. 2 mol/ L NaCl) 4 ℃抽提 4 h、离心 (15 000 g ,4 ℃,30 min) 后取上清液 (粗酶液) . 粗酶液加无水乙醇至 1 %浓度后用 0. 20 和0. 50硫酸铵分级分离获得粗酶制剂. 然后透析并适当浓缩后进行 DEA E2纤维素 (D EA E232) 离子交换柱层析 (2. 5 cm ×30. 0 cm) ,采用 0. 01 mol/ L Tris2HCl 缓冲液 (p H 7. 5) ,含 NaCl 浓度由 0 至1 mol/ L的直线梯度洗脱 ,流速为 0. 25 mL/ min ,部分收集 ,每管收集 4mL . 活力峰合并后通过 Sep hadex G2150 凝胶过滤柱层析 (2. 5 cm ×60. 0 cm) ,采用恒压装置 ,压差为 20cm. 洗脱液为 0. 01 mol/ L Tris2HCl 缓冲液 (p H 7. 5 ,含 0. 2 mol/ L NaCl) ,流速为 0. 25 mL/ min ,部分收集 ,每管体积约 4 mL . 合并活力峰 ,适当浓缩透析后再过 DEA E232 柱 ,洗脱同前 ,收集活力峰透析后进行有关测定分析.1. 2. 2 酶活力与蛋白浓度的测定AL P 活性的测定参考文献 [ 1 ]方法 ,测活温度改为 27 ℃. 酶活力单位定义为 :在上述条件下 ,每升溶液每分钟催化底物水解产生 1μmol 产物的酶量. 蛋白浓度测定按 Lowry 法[5 ] ,以牛血清白蛋白为对照.1. 2. 3 酶的纯度鉴定采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PA GE) ,分离胶浓度为 8 % Acr20. 184 % Bis ,浓缩胶浓度为 2. 5 % Acr20. 625 % Bis ,蛋白带检测采用考马斯亮兰染色法.　　图 1 　草鱼 AL P 纯化的洗脱图谱a ,c 为 DEAD232 柱 ,b 为 Sephadex G2200 柱- - ·- - 蛋白浓度 (左纵座标) ; - - о- - 酶活力 (右纵座标)　　Fig. 1 　Purification of the enzyme on DEA E232 (a ,c) and on Sephadex G2200 (b) chromatography2 　实验结果2 . 1 　酶的分离纯化结果以草鱼肠为提酶材料 ,通过缓冲液抽提、硫酸铵分级分离、DEA E232 离子交换柱层析和 Sep hadex G2200、再经 D EA E232 纯化 ,获得碱性磷酸酶制剂 ,酶比活力为 686 U/ mg. 几种柱洗脱图谱见图 1. 酶液经PA GE 呈现出一条蛋白主带 (图 2) . 说明用该方法可以有效地纯化草鱼 AL P.　　图 2 　草鱼 AL P 的电泳鉴定　　Fig. 2 　PA GE of enzyme2 . 2 　酶催化 pN PP 水解的动力学特征在 27 ℃,p H 10. 0 的测活体系中 ,以 pN PP 为底物 ,测定不同底物浓度下的酶促反应的初速度 ( vo ) ,以vo 对[ S ]作图为典型的米氏双曲线关系 ,见图 3 内插图. 说明该酶催化 pN PP 水解反应符合 Michaelis2Menten 动力学. 以 1/ v 对 1/ [ S ]作图为直线 (图 3) ,求得该酶催化 pN PP 水解的米氏常数 ( Km ) 和最大速度常数 (V m )分别为 1. 01 mmol/ L 和 5. 49μmol/ L/ min.2 . 3 　p H 和温度对酶活力的影响在 27 ℃的不同 p H 的测活体系中 ,检测 p H 对酶催化 pN PP 水解的酶活力的影响 ,结果表明 :酶活力对测活的 p H 关系图 (图略) 为典型的钟罩型曲线 ,求得该酶催化 pN PP 水解反应的最适 p H 值为 10. 41. 在p H 10. 0 的测活条件下 ,改变测活条件的反应温度 ,研究温度对酶活力的影响 ,结果表明 :酶活力对测活的温度关系为典型的钟罩型曲线 (图略) ,求得该酶催化反应的最适温度为 27 ℃.　图 3 　酶催化 pN PP 水解反应的双倒数关系图内插图为米氏双曲线关系图　Fig. 3 　Lineweaver2Burk plot for the enzyme2 . 4 　酶的 p H 稳定性取出等量的酶液 ,加入三倍体积的不同 p H 值的缓冲液 ,在 4 ℃下处理 24 h ,然后取出 50μL 处理的酶液在正常的测活体系中 (p H 10. 0 ,27 ℃) 测定酶的剩余活力 ,以酶活力对 p H 作图 (图 4) . 结果表明 ,该酶在 p H 6. 6～11. 5 区间较稳定 ,而在 p H 低于 6. 6 或高于 11. 5 ,酶很不稳定 ,酶活力丧失较快.2 . 5 　酶的温度稳定性定量酶在不同温度下保温 30 min 后冷却到室温.取 20μL 热处理的酶液在正常的测活体系 (p H 10. 0 ,27 ℃)检测酶的剩余活力 ,以酶活力对温度作图 (图5) . 实验表明 ,酶在 45 ℃以下热变性 30 min ,酶活力基·586·第 5 期 　　　　　　　　　　　　　张继平等 :草鱼碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质研究　图 4 　酶的 p H 稳定性　Fig. 4 　The p H stability of the enzyme本保持不变 ,在 45 ℃以上酶活力开始下降 ,随着处理的温度升高 ,酶活力呈快速下降.2 . 6 　几种金属离子对酶活力的影响在不含 Mg2 + 的测活体系中 ,加入不同浓度的金属离子 ,在 27 ℃测定酶活力 ,观察各种金属离子对酶活力的影响 , 结果见表 1. NaCl , NaNO3 , Na2 SO4 ,LiSO4 , KCl 等无机盐对酶活力几乎没有影响 ,到 30mmol/ L 浓度 ,酶活力基本不变 ,说明一价碱金属离子及相应的酸根离子对该酶活力无影响. MgSO4 ,CoCl2 ,MnCl2 对酶有不同的激活作用 , ZnSO4 对酶活力有显著的抑制作用.表 1 　金属离子对草鱼 AL P 活力的影响Tab. 1 　Effect s of metal ions on the enzyme activity金属离子 浓度/ (mmol ·L - 1 ) 相对活力 / %Control 100. 0NaCl 30. 0 100. 5NaNO3 30. 0 101. 8Na2 SO4 30. 0 98. 5KCl 30. 0 101. 5LiSO4 30. 0 99. 6MgSO4 1. 0 151. 5MnCl2 1. 0 157. 2CoCl2 1. 0 116. 8ZnSO4 1. 0 33. 33 　讨　论由于草鱼是无胃鱼类 ,因此 ,其营养物质的消化吸收都在肠道进行 ,肠道中的消化酶的种类和数量较多 ,组成比较复杂 ,这给 AL P 酶的提取和纯化增加了很大的难度 ,造成 AL P 最后的得率较低 ,酶活损失较大. 试　图 5 　酶的温度稳定性　Fig. 5 　The temperature stability of the enzyme验过程中虽尝试了多种方法去提高 AL P 的稳定性 ,但效果不明显. 因此 ,如何提高 AL P 在提取过程中的稳定性 ,提高酶的得率 ,有待于进一步研究.AL P 的酶学特性因动物种属不同有较大的差异.我们的实验结果表明 ,草鱼 AL P 的最适温度为 27 ℃,与其它动物来源的酶有一些差异 ,如来自于锯缘青蟹的酶为 52 ℃[1 ] 、合浦珠母贝的酶为 45 ℃[2 ] 、背角无齿蚌的酶为 40 ℃[3 ] . 反映出草鱼 AL P 最适温度跟其生长的最佳温度 (28～32 ℃) 有一定的相关性. 草鱼 AL P的最适 p H 值为 10. 41 ,以 pN PP 为底物 ,草鱼 AL P 的Km 值为 1. 01 mmol/ L ,这与其它动物也有明显差异[1～4 ,6 ] ,说明不同种类动物的 AL P 的性质不同 ,其催化能力也有明显差异.AL P 是生物体内一种重要的代谢调控酶 ,在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢过程 ,在脊椎动物的骨化作用中起着重要作用. 草鱼 AL P 参与食物中钙磷吸收等生长代谢过程并与草鱼的生长发育密切相关. 由于草鱼的食量大 ,消化吸收又主要都在肠道进行 ,其排泄量很大 ,因此 ,提高 AL P 的活性 ,从而提高饲料中磷的利用 ,促进磷的吸收 ,减少磷对水体的污染 ,具有重要的理论与实践意义. AL P 是一含 Zn 酶 ,对于金属酶而言 ,不同的离子可对它造成不同的影响.实验表明 ,一价金属离子对草鱼的 AL P 的活力没有影响 ,这与青蟹 AL P[7 ] 得出的结果相同. 可能是因为这些离子都是水体中较常见的 ,经过长期进化适应 ,AL P的结构和功能不易受这些一价金属离子的影响. 二价金属离子和过渡金属离子有的起激活作用 ,有的起抑制作用 ,这为减少与避免饲料中添加的金属离子等矿物质元素对 AL P 酶的抑制、提高 AL P 的活性提供了理论指导. 同时 ,鱼类因疾病或者所处环境受到污染 ,例如金属离子、有机物的污染等 ,其 AL P 活性必定受到影响[8～10 ] . 因此 ,可以通过监测草鱼 AL P 活性的变·686· 厦门大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2005 年化 ,及时反映草鱼健康状况 ,起到预测和预防草鱼疾病的发生 ,并可以对草鱼所生活的环境中的重金属离子等污染物进行监测 ,对草鱼的养殖与水体环境的监控具有重要的意义.参考文献 :[1 ] 　陈清西 ,张喆 ,庄总来 ,等. 锯缘青蟹碱性磷酸酶分离纯化及部分性质研究 [J ] . 海洋与湖沼 , 1998 , 29 (4) : 362 -367.[2 ] 　谢莉萍 ,林静瑜 ,肖锐 ,等. 合浦珠母贝碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究[J ] . 海洋科学 ,2000 ,24 (10) :27 - 39.[3 ] 　张洪渊 ,刘克武 ,石安静 ,等. 背角无齿蚌碱性磷酸酶的分离纯化及其动力学研究[J ] . 水生生物学报 ,1996 ,20 (1) :57 - 61.[4 ] 　陈巧 ,陈清西 ,林建城 ,等. 僧帽牡蛎碱性磷酸酶性质的研究[J ] . 台湾海峡 ,2003 ,22 (4) :475 - 479.[5 ] 　Lowry O H. Protein measurement with the Folin2phenolreagent [J ] . J . Biol. 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Pollution Bulletin ,2004 ,48 :61- 77.Purif ication and Some Characterization of Alkaline Phosphatasefrom Grass Carps( Ctenopha r yngodon idellus)ZHAN G Ji2ping ,L IN Jian2cheng ,XIE Jin2jin ,C H EN Qing2xi 3( Key Lab. of the Minist ry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering ,School of Life Sciences ,Xiamen University ,Xiamen 361005 ,China)Abstract : An alkaline phosphatase was purified f rom Grass Carps ( Ctenophary ngodon i del l us) by following procedures : Tris2HClbuffer (p H 7. 5) ext raction ,ammonium sulfate precipitation ,ion2exchange chromatography on DEA E232 cellulose ,followed by gel fil2t ration through Sephadex G2200 and ion2exchange chromatography on DEA E232. The final preparation was homogeneous on PA GE.The specific activity of the enzyme was 684 U/ mg. The optimum p H is 10. 41 ,and the optimum temperature is 27 ℃for the hydroly2sis of pN PP. Michaelis2Menten constant ( Km ) is 1. 01 mmol/ L and the maximun velocity (V m) is 5. 49 mmol/ L/ min at p H 10. 0 and27 ℃. The enzyme is stable in the range of p H f rom 6. 6 to 11. 5 and in temperature below 45 ℃. A survey of effect s of metal ions onthe enzyme showed that the positive monovalent metal ions (Li + ,Na + and K+ ) have no effect on the enzyme ;positive bivalent metalions (Mg2 + ,Mn2 + and Co2 + ) activate the enzyme ,Zn2 + inhibit the enzyme. The result indicates that different metal ions have differenteffect on the AL P. The study of AL P from Grass Carps ( Ctenophary ngodon i del l us) may give some help to Grass Carp s culture.Key words : Grass Carp s ;alkaline phosphatase ;purification ;activity ;stability ;metal ions·786·第 5 期 　　　　　　　　　　　　　张继平等 :草鱼碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质研究

草鱼碱性磷酸酶的分离纯化与部分性质研究

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