以产物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(NAG)及其类似物-葡萄糖(glu)、半乳糖(gal)、果糖(fru)和蔗糖(suc)为效应物,研究它们对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响及抑制作用机理.结果表明,上述效应物对酶均表现为可逆的抑制作用.NAG有较强的抑制作用,其IC50为0.011 mol/dm3.但产物类似物对该酶的抑制作用均弱于NAG.NAG对该酶的抑制作用机理表现为反竞争性抑制,抑制常数KIS为4.37×10-3mol/dm3;glu、gal、suc则表现为非竞争性抑制,抑制常数KI分别为0.125、0.394、0.474 mol/dm3;而fru则表现为竞争性抑制,抑制常数KI为0.455mol/dm3

张继平

杨学敏

谢进金

陈清西

颜雅雯

Xiamen University Institutional Repository

第 25卷  第 2期 台 湾 海 峡 Vo.l 25,  No. 2 2006年 5月 JOURNAL OF OCEANOGRAPHY IN TA IWAN STRA IT M ay, 2006收稿日期: 2005-05-26基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 40576066 );厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室开放基金资助项目 ( 2005101)作者简介:杨学敏 ( 1973 ~ ),女,硕士研究生.通讯作者:陈清西,男,教授 (博导 ); E-m ai:l chenqx@ jingxian. xm u. edu. cn产物及其类似物对锯缘青蟹 NAGase酶活力的影响杨学敏1, 2,张继平3,谢进金4,颜雅雯1,陈清西1( 1. 厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室、厦门大学生命科学学院,福建 厦门  361005;2.漳州职业技术学院食品与生物工程系, 福建 漳州  363000; 3. 广东佛山科学技术学院生命科学学院,广东 佛山  528231; 4. 泉州师范学院生物系, 福建 泉州  362000)摘要:以产物 N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖 (NAG)及其类似物-葡萄糖 ( g lu)、半乳糖 ( gal)、果糖 ( fru)和蔗糖 ( suc)为效应物,研究它们对锯缘青蟹 N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG ase)活力的影响及抑制作用机理. 结果表明, 上述效应物对酶均表现为可逆的抑制作用. NAG有较强的抑制作用,其 IC 50为 01011mo l/dm3. 但产物类似物对该酶的抑制作用均弱于 NAG. NAG对该酶的抑制作用机理表现为反竞争性抑制, 抑制常数K IS为 4137 @ 10- 3mol/dm3; glu、gal、suc则表现为非竞争性抑制, 抑制常数 K I分别为01125、01394、01474 mol /dm3; 而 fru则表现为竞争性抑制, 抑制常数 K I为 01455mo l/dm3.关键词:海洋生物; N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷酶; 实验研究; 锯缘青蟹; 产物及其类似物;抑制机理中图分类号: Q556. 1     文献标识码: A      文章编号: 1000-8160( 2006) 02-0229-05N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷酶 (NAG ase, EC 31211152 )能协同内切几丁质酶和外切几丁质酶将自然界中数量巨大的天然多聚物-几丁质降解为 N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖 (简称 NAG ),该酶的降解产物在生命科学、医学、化工、农业及环境科学等方面潜在的应用价值已受到越来越广泛的关注,特别是发现几丁质酶在生物体自溶、形态发生和营养代谢中具有一系列的重要作用[ 1].目前,人们已注意到 NAGase的生理过程与甲壳动物生长发育过程中的周期性蜕皮是密切相关的[ 2]. 海洋中的甲壳动物 ) ) ) 锯缘青蟹 ( Scy lla serrata )是海水养殖的优良品种,体内的NAGase是其赖以生存、生长的重要酶类之一,主要分布在青蟹内脏及壳膜. 前文, 作者报道了锯缘青蟹 N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷酶 ( NAGase)的分离纯化、理化性质的研究[ 3]. 在此基础上,作者进一步探讨产物及其类似物对该酶抑制作用及其作用机理, 这对于阐明 NAGase的催化作用机理、青蟹养殖不同生长时期的食物调配等方面具有重要的指导意义.1 材料与方法锯缘青蟹 NAGase酶制剂按文献 [ 3]方法制备, 获得 PAGE和 SDS-PAGE为单一蛋白带的台 湾 海 峡 25卷酶制剂,纯酶的比活力为 7 990U /mg; 对硝基苯-N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷 ( pNP-NAG)为上海医药工业研究院生化室产品; Sephadex G-100为 Pharmacia产品; DEAE-32为 Whatm an产品;N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖 ( NAG )、蔗糖 ( suc)、D-葡萄糖 ( g lu)、D-果糖 ( fru)、D-半乳糖 ( gal)和其它试剂均为国产 AR纯,所有溶液均以玻璃重蒸水配制.酶活力测定方法参考文献 [ 4 ], 以 pNP-NAG为底物, 在 210 cm3的反应体系中, 含 011mo l/dm3NaA c-HAc缓冲液 ( pH 518), 0125 mmo l/dm3 pNP-NAG, 加入 10 mm3酶液,在 37e 下准确反应 10m in, 加入 210 cm 3 015mo l /dm3的 N aOH终止反应,在 752型 Spectrum紫外可见分光光度计上测定波长为 405nm的光密度值 (OD 405 nm ), 消光系数按 1173 @ 104dm3/ ( mol# cm )计算[ 5]. 产物类似物对酶的抑制机理判断是通过 L inew eaver-Burk双倒数作图, 比较酶催化的动力学参数,包括表观米氏常数 (Km )和最大反应速度 ( vm )的变化来分析[ 6].2 实验结果211 产物及其类似物对青蟹 NAGase活力的影响选择产物 NAG及其类似物: g lu、gal、fru和suc为效应物,分别探讨它们对锯缘青蟹 NAGase酶活力的影响.结果表明, 上述的效应物对该酶有不同程度的抑制作用,随着抑制剂浓度的增大,酶活力逐渐下降.酶的剩余活力与抑制剂浓度的依赖关系见图 1.测得导致酶活力下降 50%所需的抑制剂浓度 ( IC50 )分别为 01011、01135、01553、01748和 01642 mo l/dm3. 抑制强度依次为: NAG> g lu> gal> suc> fru.212 抑制作用机理的判断在含不同浓度效应物的测活体系中, 固定底物浓度加入不同量的天然酶液, 检查酶的活力与加入酶量的关系. 图 2为锯缘青蟹 NA-G ase在含不同浓度的 NAG的测活体系中酶的活力与加入的酶量间的关系图 (曲线 0~ 4分别代表 NAG的浓度为: 0、5、10、15和 20mmol /dm3). 为一组通过原点的直线, 随着 NAG浓度的增大,直线的斜率降低. 说明抑制作用是属于可逆.其余的效应物 ( g lu、gal、fru和 suc)对锯缘青蟹 NAGase也表现可逆的抑制作用.213 NAG对锯缘青蟹 NAGase的抑制类型在含不同浓度 NAG的测活体系中, 固定酶的浓度,改变底物 pNP-NAG浓度,测定酶促反应的初速度. 以 L inew eaver-Burk双倒数作图 [直线 0~ 4NAG浓度分别为: 0、5、10、15和#230# 2期 杨学敏等:产物及其类似物对锯缘青蟹 NAGase酶活力的影响20mmol /dm3(图 3) ] ,得到 1组平行线.说明 NAG对锯缘青蟹 NAG ase的抑制类型为反竞争性, 酶的表观米氏常数(K m )和最大反应速度 ( vm )均随着 NAG浓度的增大而减小. NAG只能与酶-底物络合物 ( ES )结合而不能与游离酶( E )结合. 以不同浓度的 NAG下测定的1 /vm对 NAG浓度作图为一条直线 (图 3内插图 ) ,求得 NAG对酶-底物络合物的抑制常数 (K IS )为 4137 @ 10- 3mo l/dm3,结果列入表 1, 以供比较.表 1 产物及其类似物对青蟹 NAGase的抑制效应Tab11 Inh ib ito ry effects of product and its analog s on g reen crab NAGase效应物 IC50 ( m ol/dm3 ) 抑制作用 抑制类型抑制常数 ( mo l/dm3 )K I K ISN-乙酰氨基葡萄糖 01011 可逆抑制 反竞争性 - 4137@ 10- 3葡萄糖 01135 可逆抑制 非竞争性 01125 01125D-半乳糖 01553 可逆抑制 非竞争性 01394 01394D-果糖 01748 可逆抑制 竞争性 01455 -蔗糖 01642 可逆抑制 非竞争性 01474 01474214 glu、gal和 suc对青蟹 NAGase的抑制类型及抑制常数的测定探讨 glu、ga l和 suc对锯缘青蟹 NA-G ase抑制作用类型, L inew eaver-Burk双倒数作图为一组横轴截距不变的直线, 说明它们不影响表观米氏常数 (Km ), 只影响最大反应速度 ( vm ) , 其抑制效应为非竞争性类型. 图 4为 glu对该酶抑制作用的 L in-ew eaver-Burk双倒数作图 (直线 0~ 4g lu浓度 分别 为: 0、0. 05、0. 1、0. 2 和 013mo l/dm3) ,显示 g lu即可以与游离酶结合也能与酶-底物络合物结合,其结合强度相同.抑制剂与酶的结合并不影响底物与酶的结合, 它们各自独立、互不相干, 抑制剂不改变酶对底物的亲和力.以不同 g lu浓度下测定的酶促反应最大速度 vm之倒数对 g lu浓度作图 (图 4内插图 )为一条直线,从直线的斜率可以求得 glu与游离酶及酶-底物络合物结合的抑制常数 K I与 K IS (K I =K IS ).相同的方法可以求得 ga l和 suc的抑制常数,结果总结于表 1.215 fru对锯缘青蟹 NAGase的抑制类型探讨 fru对锯缘青蟹 NAGase的抑制类型.以 Linew eaver-Burk双倒数作图得到一组纵轴截距不变的直线 [直线 0~ 4 fru浓度分别为: 0、0. 2、013、014和 015 mo l /dm3 (图 5) ], 说明 fru不#231#台 湾 海 峡 25卷改变酶促反应的最大反应速度 ( vm ), 只影响米氏常数 (Km ), 其抑制表现为竞争性类型. Km 值随着抑制剂浓度的增大而增大, 表现酶对底物的亲和力下降,抑制剂的存在与底物竞争和酶的结合.相反, 底物和酶的结合也阻止了抑制剂与酶的结合,增加底物浓度可以排除抑制剂对酶的效应,表现出酶反应的vm 不随着抑制剂浓度增大而变化. 以K m对 fru浓度作图 (图 5内插图 )为一条直线,求得 fru与游离酶的结合的抑制常数 (K I ) .测定结果一并列入表 1.3 讨论本文研究产物 N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖和它的类似物葡萄糖、半乳糖、果糖和蔗糖对青蟹NAGase的抑制效应.结果表明 NAG和 g lu对酶的抑制作用较为显著, 随着抑制剂浓度的增大,酶活力呈指数的下降. NAG的抑制强度是 g lu的 13倍,显示在葡萄糖的 2c-位的羟基被乙酰氨基取代其抑制作用加强, 说明锯缘青蟹 NAGase对 2c-位的乙酰氨基有专一的识别作用.NAG类似物对该酶的抑制强度较低,当浓度达到 0180mo l/dm3时, g lu、gal、fru和 suc分别只使酶活力下降 8812%、6016%、4818%和 6012%,它们对酶的抑制作用类型研究表明,除 fru为竞争性外, g lu、ga l和 suc均为非竞争性的抑制作用机制. 上述的研究结果显示,这些底物类似物对锯缘青蟹 NAGase的效应类似于对凡纳滨对虾 ( L itop enaeus vannamei) NAGase的效应[ 7], 差异仅表现在抑制强度的不同,显示不同来源的 NAGase具有相似的催化作用机理.葡萄糖、果糖和半乳糖的化学式都是 C6H 12O6,但结构式不同, 是同分异构物.半乳糖是己醛糖,是葡萄糖的非对映体,其成环的方式与葡萄糖相同. 两者不同之处仅在于 C-4上的构型正好相反,故两者为 C-4的差向异构体,它们对酶的抑制作用均表现非竞争性.果糖为己酮糖,果糖成环的方式与葡萄糖不同,它是由 C2上的羰基 C5上的羟基结合而成的,它对酶的抑制作用与葡萄糖不同,表现为竞争性.而蔗糖是 A-D-葡萄糖和 B-D-果糖以 A-1→2糖苷键结合的二糖,对酶的抑制作用表现为非竞争性,与葡萄糖相同, 显示作用是由葡萄糖基团引起的,但在B-位上挂上果糖基团,其抑制强度大大下降, IC50增大约 4倍. 因此,各种产物类似物的抑制类型和抑制强度的差别可能是由效应物结构和组成的差异引起的.根据本实验结果,在锯缘青蟹养殖的不同时期应注意投料成份的配比, 特别是在锯缘青蟹蜕壳阶段要适当控制糖含量.参考文献:[ 1]  Broadway R M, W illiam s D L, Ka lnW C, et al. P artial character ization of chitino ly tic enzym es from Strep to-m yces albidoflavu s[ J]. Le tte rs in App lied M icrob io logy, 1995, 20: 271~ 276.[ 2]  Funke B and Spind ler K D. Character ization of chitinase from the br ine shrim p artem ia[ J] . Comp B iochem#232# 2期 杨学敏等:产物及其类似物对锯缘青蟹 NAGase酶活力的影响Physio l, 1989, 94B ( 4): 691~ 695.[ 3]  Zhang J P, Chen Q X, W ang Q, et al. Purifica tion and som e properties of B-N-A ce ty-l D- g lucosam inidasefrom v iscera of green crab ( Scylla serrata ) [ J]. B iochem (Moscow), 2006, 71 ( Sup. 1): 55~ 59.[ 4]  X ie X L, Chen Q X, L in J C, et al. Purification and som e properties ofB-N-A ce ty-l D- g luco sam in idase frompraw n (P enaeus vannam ei) [ J]. Mar B io l, 2004, 146: 143~ 148.[ 5]  Chen Q X, ZhangW, ZhengW Z, et al. K inetics of inhib ition o f alka line phosphatase from g reen crab( Scy llaserrata) by N-B romosucc in im ide[ J]. J Pro te in Chem, 1996, 15( 4): 345~ 350.[ 6]  Chen Q X, Ke L N, Song K K, et al. Inh ib itory effects of hexy lresorcino l and dodecy lresorc ino l on mushroom(Agaricus b isporus) tyrosinase[ J]. The Pro te in Journa l, 2004, 23( 2) : 135~ 141.[ 7]  谢晓兰, 王勤,陈清西. 产物类似物对南美白对虾 N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响 [ J] . 厦门大学学报 (自然科学版 ), 2004, 43 ( Sup. ): 24~ 27.Inhibitory effects of product and its analogson N-acety-lB-D-glucosam inidase from green crab(Scy lla se rra ta )YANG Xue-m in1, 2, ZHANG J-i ping3, X IE Jin- jin4, YAN Ya-w en1, CHEN Q ing-x i1( 1. Key Laborato ry o fM inistry of Education for Ce ll B iology and Tum or C ell Eng ineer ing / Schoo l of L ife Sciences,X iam en University, X iam en 361005, China; 2. Departm ent o f Food & B ioeng ineer ing, Zhang zhou Institute o fTechno logy, Zhangzhou 363000, Ch ina; 3. Schoo l of L ife Sciences, F oshan Sc ience and Techno logy Co llege,Foshan 528231, Ch ina; 4. Departm ent o f B iology, Quanzhuo Norm a lUn iversity, Quanzhuo 362000, China)Abstrac:t In th is paper, the inhibitory effect andm echan ism of product and its ana logs on the activ-ity ofNAGase from g reen crab ( Scy lla serrata) have been studied. The results show thatNAG, g lu-cose, ga lactose, frurose and sucrose can inhibit the enzyme activ ity for the hydro lysis o f pNP-NAGand its inh ib it ion is reversib le reaction w ith remaining activity. Product (NAG ) ismost poten t in thetested compounds. The inhib ito r concentration lead ing to 50% o f enzyme act iv ity lost ( IC50 ) w as es-t imated to be 01011 mol /dm3. H ow ever, the inhibito ry ab ility o f product analogs w as much w eakerthan that o fNAG. The inh ib itory type o fNAG on the enzymew as found to be uncompetit ive and theinh ib ito ry constant (K IS ) w as determ ined to be 4. 37 @ 10- 3mo l/dm3. G lucose, ga lactose, sucrosew ere c lassif ied as noncompetitive inh ib itors and the ir inh ib itory constant w ere determ ined to be0. 125, 0. 394 and 0. 474 mo l/dm3, respectively. Frurose w as classified as compet itive and the in-h ib ito ry constant w as determ ined to be 0. 455mo l/dm3.Key words: marine biology; N-acety-l B-D-glucosam inidase; experim enta l research; green crab(S cylla serrata ); product and its analog s; inhibitorym echan ism(责任编辑:林秀清 )#233#

产物及其类似物对锯缘青蟹NAGase酶活力的影响

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/19826/%e4%ba%a7%e7%89%a9%e5%8f%8a%e5%85%b6%e7%b1%bb%e4%bc%bc%e7%89%a9%e5%af%b9%e9%94%af%e7%bc%98%e9%9d%92%e8%9f%b9NAGase%e9%85%b6%e6%b4%bb%e5%8a%9b%e7%9a%84%e5%bd%b1%e5%93%8d.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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