用绿色荧光前体化合物CalceinAM标记靶细胞,经过与杀伤性T淋巴细胞(CTL)效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测CTL效应。通过对一系列标记条件的研究:不同浓度CalceinAM标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定CalceinAM荧光素标记法的最佳条件。用该方法检测乙型肝炎病毒表面抗原的DNA疫苗免疫Balb/c小鼠对P815S细胞的CTL效应,E/T比为10时,杀伤效率接近饱和,达到65%。通过荧光显微镜直接观察杀伤后的P815S细胞,细胞破裂程度与计算出的杀伤效率有一定相关性

何水珍

吴婷

夏宁邵

张军

欧山海

程通

陈敏

Xiamen University Institutional Repository

第 卷 第 期年 月病 毒 学 报荧光素标记检测 乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性 淋巴细胞方法的探讨吴婷,陈敏,欧 山海,何水珍,程通,张军,夏宁邵厦门大学 福建省医学分子病毒学研究中心,福建 厦门摘要 用绿色荧光前体化合物 标记靶细胞,经过与杀伤性 淋巴细胞 效应细胞数小时的孵育,通过分析培养上清中的荧光强度检测 效应。通过对一系列标记条件的研究 不 同浓度 标记靶细胞、不同洗涤缓冲液、不同标记细胞浓度、不同洗涤次数、不同裂解液配方,确定 荧光素标记法的最佳条件。用该方法检测 乙 型肝炎病毒表面抗原的 疫苗免疫 小 鼠对 细胞的 效应,厅 比为 时,杀伤效率接近饱和,达到。通过荧光显微镜直接观察杀伤后 的 细胞,细胞破裂程度与计算 出的杀伤效率有一定相关性。关健词 绿色荧光前体化合物 细胞免疫 乙型肝炎表面抗原中图分类号 文 献标识码 文章编号 一 【 一 一 一杀伤性 淋 巴 细胞 在 消除体 内病毒感染、抗移植免疫、抗肿瘤免疫过程 中起着极其重要的作用 〔‘一 〕, 建立灵敏、快速 的 检测方法是免疫学家们不断追求 的 目标 ’, 〕。在疫苗研制、病毒性疾病致病机理、抗肿瘤免疫研究 中,的检测是一个十分重要的组成部分,目前最常用的 检测方法为 , 释放法困,但该方法需要专 门的同位素操作室,大大 限制 了该方法 的推广使用 其它检 测 方 法 包 括 酶 联 免 疫 斑 点 分 析 实 验邵 汇,”〕、 四 聚体分析 「 〕、乳酸脱氢酶释放法 〔‘“ 〕、流式细胞仪分析〔‘ , 〕等方法。这些 方法存在检测结果不直接反映,杀伤靶细胞活性,灵敏度不高或操作步骤繁琐等缺点。年 等 ’ 〕尝试 了使用绿色荧光前体化合 物 标 记靶 细 胞 的方 法 检 测效应,但该方法 的本底较 高,影 响该方法 的检测灵敏度。本文在其基础上改进 了 标记的检测条件,改变荧光标记靶细胞的裂解液配方,降低本底,用该方法对乙 型肝炎病毒表面抗原戈 疫苗免疫 鼠的 效应。材料与方法收稿 期 一 一,修回 日期 一 一甚金项 目 教育部跨世纪人才优秀培养计划作者简介 吴婷 一,女,博士,讲师。通讯作者 夏宁邵,厦门大学福建省医学分子病毒学研究 中心,一 姐细胞株和质粒 巧 为染色体内整合有 印 基 因的稳定转染细胞株,其母代细胞株一 “ 编号一为小 鼠肥大细胞瘤细胞,均 由香港大学 教授实验室惠赠。用 于 痘 苗病 毒扩 增 的 非 洲 绿 猴 肾细胞一,编号一和用于痘苗病毒的重组人骨髓瘤细胞一编号一均购 自。质粒, 一由本室构建,即在载体 购 自的多克隆位点 中插人单拷 贝。质粒大量提取采用。重组痘苗病毒用载体,由香港大学 教授实验室惠赠。试剂和仪器 购 自 公司。细胞 培 养 基、 、 、质 粒 转 染 试 剂 印购 自。侣 检测试剂盒购 自北京万泰生物药业 有限公 司。微孔板荧光检测仪产 购 自 公 司 荧光倒置显微镜为 压 型。曰 标记靶细胞及荧光 自发 释放 率 的计算 用含 的 洗涤对数生长期的 巧 细胞次,计数。取、或 的 细胞 据具体实 验 而 定,重 悬 于 拌 含、几 或据具 体 实验 而 定 的 中,℃孵育,洗涤 一 次 据具体实验而定,重悬 于 无 酚 红 含、几 谷 氨 酞 胺、】、青 霉 素 钠、硫 酸 链 霉素,调节细胞浓度至每 拜 含、或 个细胞 据 具体实验 而 定,取 川 至 孔 型 板。加 人· ·病 毒 学 报 卷拌 无 酚 红 或 卜 不 同 浓 度 一据 具 体 实 验 而 定、 、,℃ 培养箱孵育,离心,取 拜上清液,微孔板荧光检测仪 激发波长、发射波长 检测荧光强度。分别检测荧光 自发释放值 值 或全裂解荧光值 值。荧光 自发释放率 二。每次实验均采用 孔重复,取平均值分析。重组痘苗病奏的构建、扩增及病毒滴度测定 用 限制性内切 酶 石汾口 酶 切 质 粒一 一由本 室 构 建,为一载体上插人 基因,回收 的片段,插人经限制性内切酶 工线性化的载体 中,置于痘苗病毒早晚期启动子 下游,构建重组痘苗病毒用载体一图。载 体 构建重组 痘苗病 毒 的 具体方 法 参照 文献 〔’。野生痘苗病毒 感染一细胞,℃感染 后转染一质粒 具体方法详见转染试剂 州 矛 产品说明,后 刮下细胞,冻融 次,作为重组病毒一储存液。将重组病毒储存液稀释不 同倍数后感染一细胞,℃,洗 次,加人含一澳脱氧尿啥吮、 拌一,、低熔点琼脂搪的,后挑取蓝色空斑,进一步用一细胞扩增。按试剂盒说明书检测 的表达。获得的病毒用一细胞测定病毒滴度。将 种人 孔板 内,待细胞铺满约,洗 次。将获得的病毒液用 做 倍系列稀释,分别取 讨感染细胞,℃,弃去病毒液,洗 次,加人含· 、拌一,、低溶 点琼脂糖 的,后计数蓝色空斑,计算病毒滴度 蓝色空斑数 又 稀释倍数。腹腔注射一 。天后,取小 鼠脾脏检测。的检测 取免疫后小 鼠脾脏,注射器研磨,目筛网过滤,洗涤后离心,氏 室温处理,加人,离心,洗涤后重悬 于含、非必 需 氨 基 酸、拜 几 任琉基 乙 醇、谷氨酞胺、丙 酮 酸钠、一、青霉素钠、八 硫酸链霉素 中,种 孔板,细胞厅。用 个感染复数 的重组痘苗病毒一℃感染 鼠脾脏细胞 做为刺激细胞,刺激细胞与反应细胞 的 比例为,℃ 毛培养箱培养天,每天 补充 培养 液。检 测 时 标 记 巧 和细胞作为靶细胞,标记方法同。将效应细胞与靶细胞以效 靶比 汀 分别为、 、 、的 比例种人孔 圆底板,离心,℃ 培养箱孵 育,离心,取 川上清液,检测荧光强度。分别用 无酚红 及 裂解液 孵育荧光素标记的靶细胞,以检测其 , 值及 值,对靶细胞的裂解率 二 样品荧光值一 一 。结 果图 质粒一图谱一疫苗的构建 用 限制性 内切酶 球 和‘。 工酶切质粒一不,插人经限制性内切酶 和 及。工线 性 化 的 载 体 中,转 染 细 胞 由 于细胞的转染效率及 启动子在其中的表达效率较高,故选择该细胞,法确证 户一能够在哺乳动物细胞内表达有活性的 八召。免疫小鼠 取 一 周龄的 以 鼠 级,腿部肌肉注射 拌 车 月一闪,两周后加强 针,第 四周末不 同裂解液对 标记靶细胞荧光释放的影响在计算,的杀伤效率时,裂解液裂解靶细胞测得的全裂解荧光值的大小,对于杀伤效率的计算有着重要 的影 响。用裂解液处理荧 光标记靶细胞后,靶细胞完全破裂,荧光释放至上清液,此时测得的荧光值与靶细胞 的总量呈正相关。在研究 中发现,采 用 裂 解 液 几氏 ’ 〕,测得 的 较高。而改用裂解细胞 测得上 清液 的全裂解 荧 光值,比用孵育细胞测得的荧光 自发释放值还低 结果未显示,故推测裂解液可能会对荧光产生淬灭作用。因此试验用不 同浓度 的 裂解液和 裂解液裂解细胞,以选择对细胞释放荧光淬灭最小的裂解液。结果表明 图,裂解细胞后测得的 值最低。不 同洗涤缓冲液及不 同洗涤次数对荧光 自发释放的影响用 标记靶细胞之后,需要经过多次洗涤以去除细胞外的游离荧光素,充分而不过量 的洗涤条件对于有效降低 值非常重要。洗涤次数太少,游离荧光素的存在造成荧光 自发释放增高的假象 洗涤次数过多可能损伤细胞膜,亦会造成荧光 自发释放增高。试验 了不 同洗涤缓冲液,不 同洗期 吴婷等 荧光素标记检测 乙 型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性 淋巴细胞方法的探讨朋工附今 心冬阴一‘,书以既来计算靶细胞的裂解率。因此,已标记的靶细胞破裂后释放的荧光强度与靶细胞数量是否成正 比直接影响检测结果。检测不 同浓度 。二 标记靶细胞后,不同数量靶细胞全裂解的荧光强度,结果表明,不论用何种浓度 标记,靶细胞全裂解的荧光强度与靶细胞数量呈 良好的线性关系 图。沙一咐。一‘巴山》〔踢 曰‘ “川 、 汪 工一 《一卜 卜 比一州卜 林林图 不同裂解液裂解 标记细胞测得的全裂解荧光值比较条次数对 的影 响,结 果 图 表 明,用 含的 洗涤 次,最低。一剖 明别〕一产月曰上甲为印一卯别 洲 别洲】 《洲城川注跳 今一 心 一黝冬 , 既住 既图 不同洗涤缓 冲液及不 同洗涤次数对荧光 自发释放的影响使用浓度和初始细胞密度的选择分 别 用 拌 几、拼 几 和 拼 几 的标记细胞,其 值分别为 士、士 和 土,不 同浓度标记的 值未见 明显差别,以 拌 几标记较低一些。用 拌 几 标记初始密度分别 为只 、 和 的靶细胞,其值分别 为 士、士 和士 , 未见 明显差别,但似乎有 随着靶细胞密度的增加 值呈升高的趋势。最 终 确 定 标 记 条 件 为 拌℃标记,标记细胞密度为 一,洗涤缓冲液为,洗涤 次,细胞全裂解液采用。标记细胞数与上清 中荧光强度 的相关性标记靶细胞的方法检测 效应,是通过检测效应细胞与靶细胞培养上清的荧光强度图 不同浓度 滋 标记细胞的孵育上清中的荧光强度与细胞数量的关系用改 良 标记法检测·免疫鼠的以一免 疫 鼠 周 后,痘苗病毒一加强 针,天后取脾脏细胞,体外刺激 天后,荧光素标记法检测其效应细胞对、细胞 的杀伤作用。以空白载体 免疫 的 鼠作为阴性对照。结果 图 表 明, 一免疫 鼠在 厅 比为时,对 的裂解率 即接近饱和,达到 左右 而对 阴性对 照 的裂解率仅有。空白载体 免疫 鼠对 巧、巧 细胞 的杀伤效率均在 以 内。今 一 , 尸 一瞥 军坐辈竺一,以肠 卜“ 妥 三三三三三三书跳 ‘匕二二‘二二 一 二一‘一山一 ——一艺孰。巴比从 〕图 疫苗免疫 鼠对 的特异性 应答诬 卯在 荧 光 显 微 镜 下 直 接 观 察 杀 伤 后 的细胞,可见 汀 比为 时,已几乎见不到形态完整的细胞,而仅可见细胞残骸 图。· 卷曰】,曰 ,图 荧光显微镜观察 疫苗免疫鼠 对靶细胞的杀伤效应〕讨 论用含 的 洗涤 次,细胞全裂解液采用。以 荧光素标记法检测一免疫,重组痘苗病毒一加强的 鼠的效应,结果表明 汀 比为 时,杀伤效率即可达到。用荧光倒置显微镜直接观察杀伤后的靶细胞,发现在 无酚红 中培养 的靶细胞形态完整,透光率好,说 明 荧光素标记对细胞活性没有影响。而随着 比例的增多,细胞破裂程度增加,待效靶 比增至 时,靶细胞 已基本完全破裂,荧光素基本释放至上清液中,但细胞残骸上仍粘有少量 的绿 色荧光。标记法检测 效应操作简单,检测快速,并且可 以通过荧光显微镜直接观察杀伤效果。参考文献目前国际上最常用的 检测方法为 释放法,该方法将 效应细胞与同位素 , 标记的靶细胞孵育数小时之后,被 杀伤的靶 细胞将 释放 至 上 清液 中,通 过一计数仪 检 测上 清中 , 的释放量即可计算杀伤效率。该方法检测本底低,灵敏度高,但成本较高,操作复杂,需要专门的同位素操作室,且对操作者的健康和环保不利。近几年来,人们一直在积极寻找非同位素的检测方 法,新 的 检 测 系 统 陆 续 被 报 道。例 如一 “ 、 抗原肤特异 四聚体染色法 〔 〕、流式细胞仪检测〔川等方法。前二者是间接检测法,通过分析 分泌 的细胞因子及一抗原肤 四 聚体与 表面 的结合检测 效应,该方法不如直接检测 对特异性靶细胞的杀伤客观,受影响因素较 多。流式 细 胞 仪 检 测 法 可 以 同时 分析的细胞表面标志,获得信息较多,但样 品制备步骤繁琐,检测过程耗时,且对检测人员的要求高,不适宜用作大量样品的检测。是绿色荧光素 的乙酞氧 甲基醋,经被动转运进入细胞后被酷酶水解成绿色荧光素,被滞留于完整 的细胞膜 内,当细胞膜损伤时,释放 出胞外。通过荧光酶标仪分析培养上清中的绿色荧光强度,即可检测对靶细胞 的杀伤效率。本实验在 等工‘ 〕的实验基础上改进 了 标记 的细胞全裂解液配方,降低本底,确定 荧光素标记法的最 佳 条 件 为 ” 几 ℃标 记,标记细胞密度为 细胞 拌,标记后, 〕 , ,叩一〕一 ,〕 , , 一〔, , ,伴叮昭一 。 。帅, , 一〕, , ,明卿,叩,切。 记, , 一,八刀,灿。界 石外 帅 外 〔〕冈, , 一 一,吃一明之厂泛为 。钻, , 一, ,” 卜 姐电 ￡, ‘ 泪】, 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荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21220/%e8%8d%a7%e5%85%89%e7%b4%a0%e6%a0%87%e8%ae%b0%e6%a3%80%e6%b5%8b%e4%b9%99%e5%9e%8b%e8%82%9d%e7%82%8e%e7%97%85%e6%af%92%e8%a1%a8%e9%9d%a2%e6%8a%97%e5%8e%9f%e7%89%b9%e5%bc%82%e6%80%a7%e6%9d%80%e4%bc%a4%e6%80%a7T%e6%b7%8b%e5%b7%b4%e7%bb%86%e8%83%9e%e6%96%b9%e6%b3%95%e7%9a%84%e6%8e%a2%e8%ae%a8.pdf?sequence=1&isAllowed=y

荧光素标记检测乙型肝炎病毒表面抗原特异性杀伤性T淋巴细胞方法的探讨

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