E.coli中表达的HEV衣壳蛋白片段P239(aa368~606)形成的类病毒颗粒与戊肝患者恢复期血清及中和单抗具有良好的反应性,较好地模拟了天然HEV病毒颗粒的表面空间结构。利用P239吸附HepG2细胞的模型来模拟HEV对宿主细胞的吸附,多株中和单抗对吸附的阻断验证了吸附的特异性。P239与多株传代细胞系的吸附结果则表明了这种特异性吸附的细胞选择性。对阻断P239吸附的线性单抗进行定位,初步确定了P239与细胞相互作用的区域:ORF2上的aa423~443很可能和病毒上的细胞膜受体结合部位非常靠近,或可能直接参与构成了病毒与细胞特异性识别的表位。此本研究为进一步研究HEV与宿主细胞的相互作用提供一定的线索

何水珍

吴婷

夏宁邵

张军

苗季

谢明辉

郑子峥

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戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究何水珍, 郑子峥,吴婷,谢明辉,苗季,张军, 夏宁邵*(厦门大学  国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,福建省医学分子病毒学研究中心, 福建 厦门  361005)摘要 : E1 coli 中表达的 HEV 衣壳蛋白片段 P239( aa368~ 606)形成的类病毒颗粒与戊肝患者恢复期血清及中和单抗具有良好的反应性,较好地模拟了天然 HEV 病毒颗粒的表面空间结构。利用 P239 吸附 HepG2 细胞的模型来模拟HEV 对宿主细胞的吸附, 多株中和单抗对吸附的阻断验证了吸附的特异性。P239 与多株传代细胞系的吸附结果则表明了这种特异性吸附的细胞选择性。对阻断 P239 吸附的线性单抗进行定位, 初步确定了 P239 与细胞相互作用的区域: ORF2 上的 aa423~ 443很可能和病毒上的细胞膜受体结合部位非常靠近, 或可能直接参与构成了病毒与细胞特异性识别的表位。此本研究为进一步研究 HEV 与宿主细胞的相互作用提供一定的线索。关键词:戊型肝炎病毒( HEV) ; 类病毒颗粒 P239; HepG2; 单抗阻断中图分类号: R3731 2   文献标识码: A   文章编号: 1000- 8721( 2006) 06- 0426- 05收稿日期: 2006- 07- 12; 修回日期: 2006- 09- 18基金项目: 863 计划 ( 2005AA2Z3H 20) , 福建省科技重大专项( 2004YZ01) ,厦门市重大产业科技项目( 3502Z20041008)通讯作者:夏宁邵研究员, E- mail: nsxia@xmu. edu. cn  戊型肝炎病毒( hepatit is E virus, HEV)引发戊型肝炎,主要经粪口传播,是发展中国家急性病毒性肝炎的主要病因之一[ 1]。HEV 大小约 27~ 34nm,无包膜,基因组为 715kb的单股正链 RNA, 包含 3个开放读码框( ORF) , 其中 ORF2编码的 660 个氨基酸组成病毒衣壳[ 1]。现有研究结果表明 HEV 的主要中和表位区域集中于 ORF2的 aa459~ 606 之间[ 2- 4] , 李少伟等在 E1 coli 中表达 HEV 衣壳蛋白片段 P239( aa368~ 606)形成的类病毒颗粒与戊肝患者恢复期血清及中和单抗具有良好的反应性, 作为疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性, 说明P239较好地模拟了天然HEV 病毒颗粒的表面空间结构[ 5- 8]。迄今仍没有有效的 HEV 细胞培养模型, 且难以获得大量纯化的天然 HEV, 因此对 HEV 感染过程的了解并不清楚。Purcell等发现 HepG2、HuH7、PLC/ PRF5和 A549 等细胞能吸附天然的 HEV 病毒且HEV对 HepG2细胞有一定的感染能力[ 9- 11]。在原代肝细胞难以获得的情况下, 本研究以HepG2为细胞模型, 利用能较好模拟天然 HEV 的类病毒颗粒 P239 研究 HEV 对宿主细胞的吸附, 并利用P239区段的 15肽肽库对有阻断作用的线性单抗进行定位,初步确定了 P239与细胞相互作用的区域。材料与方法1  细胞培养  HepG2、Huh 7、P815 细胞来自 ATCC,培养条件为 10% FBS( Hyclone) , DMEM , 100Lg / mL 青霉素, 100Lg/mL 链霉素, 37e 5% CO2培养箱培养。PLC/ PRF5、A549 细胞来自 ATCC, 培养条件为 10% FBS ( Hyclone) , MEM ,100Lg/ mL 青霉素, 100Lg/ mL 链霉素, 37 e 5% CO2 培养箱培养。2  蛋白的表达与纯化  P239( aa368~ 606)的表达与初步纯化如文献[ 5]所述。3  单克隆抗体  8H3、8C11、12A10、15B2、16D7 等 HEV 单抗均来源于 HEV ORF2 重组蛋白免疫的小鼠 , 其中 8H3、8C11 为构象型单抗, 12A10、15B2、16D7 为线性单抗。在恒河猴上的实验表明 8H3、8C11 能在体内中和 HEV 感染, 为中和性单抗[ 3, 7]。相应的 Fab 片段制备按文献[ 12]进行。两株对照单抗: 4D11 来源于 HBV 的表面抗原免疫的小鼠, 2F2来源于 HIV P24免疫的小鼠。4 蛋白印迹实验( Western blotting)  按常规方法操作, 处理好的样品 12% SDS-PAGE 后转移到硝酸纤维膜进行杂交,一抗为抗 HEV单抗 15B2,二抗为羊抗鼠 I gG-AP。5 流式细胞仪分析 P239 的吸附  培养细胞达到 80% ~90%汇合后, 用 01 25%胰蛋白酶/ 0102% EDTA消化, PBS 洗2 次( 1 000r/ min, 5min/次) , 将细胞重新悬浮, 2% 台盼蓝染色, 显微镜下计数。以每管 2 @ 105/ mL 的密度将细胞平均分配于流式管中, 分别加入 P239、P239 与单抗的混合液及其相应的同型对照 37 e 孵育 30 min, PBS 洗 3 次( 1 000r/min, 5min/次) ; 单抗 15B2 37e 孵育 30min , PBS 洗 3 次( 1 000r / min, 5min/次) ; 抗鼠-F ITC> 4e 避光孵育 30min,PBS 洗 2 次( 1 000r/ min, 5min/次) ,流式细胞仪分析。6 阻断 ELISA 实验  用改良过碘酸钠法标记单抗 12A10和 8C11, 用 ELISA 法进行相互阻断实验。取每孔 0105Lg/第 22卷  第 6期2 0 0 6 年 1 1 月        病   毒   学   报CH INESE JOURNAL OF VIROLOGY        Vol. 22     No. 6November   2 0 0 6mL P239 包被的 ELISA 板, 分为两组, 第一组分别加入100Ll/孔的 12A10和 12A10的 Fab 片段(分别以 20%的小牛血清 PBS 稀释至 ELISA 滴度为 1: 100 000) , 另外一个孔中加入 20% 小牛血清 PBS 作为对照; 第二组分别加入相同ELISA 滴度的 8C11 和 8C11 的 Fab 片段及一个空白孔; 37e孵育 30min;吸弃液体, 在第一组孔中加入 100Ll/孔的辣根过氧化物酶( HRP) 标记的 8C11(以 20 %小牛血清 PSB 稀释至1: 100 000 ELISA 滴度 ) , 第二组孔中加入 100Ll/孔的相同ELISA滴度的 HRP 标记的 12A10; 37 e 孵育 30min; 用 PBST洗涤 5 次并扣干后, 加入显色剂, 37e 温育 15min, 2mol/ L 硫酸 50Ll终止反应,酶标仪上读取 OD450/ 620nm的读值。7  蛋白与 HepG2 细胞的吸附及阻断  100ml细胞培养瓶中的细胞生长达到 95% 汇合率后, 胰酶消化细胞, 加入培养基,放入 37e CO 2 培养箱再培养复苏 2h。2h 后收细胞于15ml离心管, 4 e 预冷的 PBS 洗 2 遍, 冷 PBS 重悬并以每管1 @ 106 个细胞分装入 115ml 管, 每管加入 30Lg P239 及300Lg的阻断单抗(对照组则加相应体积的冷 PBS) ,总反应体系为 300Ll, 4 e 反应 11 5h, 冷 PBS 洗 3 遍 ( 500Ll/次)。从第 3次 PBS 重悬的细胞悬浮液中取 20Ll, 其中 10Ll台盼蓝染色观察细胞状态, 另外 10Ll以 PBS 稀释至 100Ll, 测定其OD600值,用( OD600@ 1 000) Ll体积的 PBS 稀释反应后的细胞,加入 6 @ 蛋白上样缓冲液, 沸水浴 10min, 样品再稀释 5倍, Western blotting 检测 P239 的结合量。8  线性单抗决定簇的定位  根据 HEV ORF2 的 aa368~606 区段合成重叠 10 个氨基酸的 15 肽肽库。以 01 05mol/ L碳酸盐包被缓冲液 ( CB, pH915)将每个肽分别稀释成 1Lg /mL ,每孔 100Ll包被于微孔板, 37e 吸附过夜; PBST 洗涤 1遍,每孔 200Ll 5%的牛血清白蛋白 37e 封闭 2h; 将封闭液甩干后,加入需要检测的单抗 37 e 反应 30min, 用 PBST 洗涤5 次并扣干;每孔加入 100Ll HRP 标记的羊抗鼠 IgG 37e反应 30min; PBST 洗涤 5 次并扣干, 加入显色剂, 37 e 温育10min, 终止,读取 OD450/ 620nm的读值。结   果1  P239对多种细胞系的特异性吸附P239与多种细胞系吸附的结果与 Purcell等[ 11]的研究基本相似,即 P239类病毒颗粒与HpG2、Huh7、PLC/ PRF5及 A549均有能被中和单抗所阻断的特异性吸附,而对鼠源肥大细胞 P815 则不吸附(图1) ,说明 P239 对传代细胞系的吸附有一定的选择性。以 HepG2 为模型的进一步研究表明这种吸附为中和单抗 8C11 阻断而非 HEV 单抗则未表现出阻断效果(图 2)。且随着 8C11浓度的降低,阻断率逐渐降低。另一株中和单抗 8H3也表现出类似的抗体浓度和阻断效果的正相关(图 3)。这些结果提示了 P239类病毒颗粒与细胞株的相互作用较好的图 1 P239 与不同细胞系的特异性吸附F igure 1 The special binding of P239 to different cell lines图 2 P239 对 HepG2 细胞的吸附及中和单抗 8C11 对此吸附特异性阻断F igur e 2  The binding of P239 to HepG2 cell and theblocking by neutralizing MAb 8C11A. Western blott ing; B. Flow cytometry.图 3  不同浓度的中和单抗 8C11 和8H3 对 P239 与 HepG2 细胞吸附的阻断Figure 3 T he results of tw o- fold serial dilutedneutralizing MAbs 8C11 and 8H3blocked the binding of P239 to HepG2 cell#427# 6 期         何水珍等: 戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究模拟了 HEV 天然病毒对这些细胞的特异吸附, 因此, P239一定程度上可以替代 HEV 天然病毒以研究感染初步发生的事件。2  线性单抗阻断 P239与 HepG2的吸附为了确定 P239和 HepG2的相互作用区域, 我们检测了 3株 HEV 线性单抗对 HepG2吸附 P239的阻断作用。其中 15B2 没有阻断作用, 而 12A10和16D7则与两株中和单抗 8C11 和 8H3有相似的效果,能完全阻断 P239对 HepG2的吸附(图 4)。图 4  线性单抗对 P239 与 HepG2 细胞吸附阻断Figure 4  Blocking the binding of P239 toHepG2 cell with different linear MAbs3  线性单抗表位的确定由于 8C11为构象型单抗难以精确定位其识别的表位,为了确定 P239与 HepG2细胞的结合区域,我们用 15肽的肽库对具阻断效果的这两株线性单抗及 15B2的表位进行定位。结果表明这 3株线性单抗的表位集中在HEV ORF2 aa398~ 452(图 5)。12A10和 16D7 的表位相互重叠, 前者为 aa423 ~438, 后者为 aa428~ 448。而 15B2 表位, aa403 ~418,位于 12A10表位的 N 端。单抗相互阻断实验表明完整的 12A10和 8C11能部分阻断对方的活性而二者的 Fab段对对方均无影响(图 6) , 表明二者的表位在空间上临近但相互分离。他们在 ORF2上的定位关系如示意图 7。图 5 线性单抗与 HEV ORF2 15 肽肽库的反应性Figure 5  T he reactiv ity of linearMAbs w ith peptides of HEV图 6 8C11 与 12A10 的交叉阻断 ELISAFigure 6  Cross-blocking EL ISA amongMAb 8C11 and MAb 12A10图 7  各表位在 ORF2 上的定位Figure 7  Locat ion of MAbs. epitope on ORF2讨   论HEV 病毒至今没有有效的体外增殖手段,天然病毒的分离由于来源有限及 HEV 自身的不稳定性[ 9]难以广泛的应用于研究中, 类病毒颗粒提供了一个可能的替代研究手段。我们利用 HEV VLPsP239尝试建立模拟病毒与宿主细胞相互结合过程的细胞模型, 结果表明 VLPs P239 与细胞之间具有很好的结合活性, 且这种结合存在一定的种属特异性,与 Purecell用活病毒 Sar55所获得的结果是基本一致的[ 11]。在抗体的阻断实验上我们发现, 能够阻#428# 病   毒   学   报                 22 卷  断P239与细胞间结合的 HEV 单抗基本上都存在某种程度的相互作用, 表明这些单抗的结合位点在空间上是相互靠近甚至是重叠的, 从而可以看出P239与细胞间的这种相互作用是通过其表面的某个特异性的位点来实现的, 相应的细胞膜上也应该存在由一个或几个蛋白或非蛋白构成的与 P239 上该位点相互作用的受体位点。因此,我们可以认为,P239与细胞间的这种相互作用所依赖的是位点间的特异性识别, 而非一种非特异的粘附,这一过程很可能模拟了 HEV 感染宿主细胞的第一个环节 ) ) )特异性识别与结合。主要免疫优势功能区之外的抗体 12A10 与16D7对 P239与细胞间的结合作用也能产生明显的阻断效果, 且 12A10 与 8C11 Fab 段的抗体间相互阻断的结果表明,二者位点虽然相互靠近,但是都相互独立。这提示了在最初所认为的主要中和表位区域之外的 ORF2上可能还存在另一个区段在介导病毒与细胞的结合中起重要作用。通过对线性单抗12A10及 16D7 进行多肽上定位, 我们发现这一区域位于 ORF2 的 aa423~ 443 之间。该区段原本只知道是使主要免疫功能区 aa459~ 601获得充分的暴露而作为环境氨基酸存在[ 8] ,但从本实验的结果上看,该区域很可能和病毒上的细胞膜受体结合部位非常靠近,或直接参与构成了病毒与细胞特异性识别的表位。由于 8C11作为构象单抗难以进行精确定位,所以无法确切了解是哪些区段参与了结合表位的形成,但这一结果至少表明,在主要免疫功能区 aa459~606之间确实存在一个或几个区段参与了结合表位的形成,这可能也是该区段的体外表达蛋白能够诱发生物体对HEV 的免疫力的原因。参考文献:[ 1] Purcell R, Emerson S. 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New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998: 627- 629.#429# 6 期         何水珍等: 戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究The Establishment of Cellular Attachment Model for Hepatitis E Virus (HEV)and Its Application in the Identification of HEV Cellular Attachment RegionHE Shu-i zhen, ZHENG Z-i zheng, WU T ing, XIE M ing-hui, MIAO Ji, ZHANG Jun, XIA Ning-shao( National Insti tute of Diag nosti cs and Vaccine De velopment of Inf ec tious Di sease , X iamen Univ ersi ty , Xiamen 361005, China ;Research Center f or Med ical Molecular Virology of Fuj ian Province , X iamen Univ ersit y, X iamen 361005, China)Abstract:We have previously expressed a recombinant hepatit is E virus capsid protein p239 ( ORF2, aa368-606)w hich show ed good immunogenicity and react ivity, and has been conf irmed to have a simulated st ructure com-pared w ith nat ive v iruses1 In the present study, p239 w as used to simulate nat ive HEV to invest igate the at tach-ment of HEV on host cells1 Our data show ed that p239 specifically attached on HepG2 cells as several HEV neu-tralizing monoclonal ant ibodies ( MAbs) could block p239 at tachment on cell surface1 Further, by using MAbsagainst linear epitopes of p239, w e identified a possible cellular binding site ( aa423-443) for the capsid protein ofHEV1 Our data provide an important clue for the further analy zing of HEV-host cell interact ion1Key words: hepatit is E virus ( HEV) ; VLP P239; HepG2 cell; MAbs blockingCor responding author : XI A N ing-shao, E-mai l : nsxia@x mu . ed u . cn#430# 病   毒   学   报                 22 卷  

戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21175/%e6%88%8a%e5%9e%8b%e8%82%9d%e7%82%8e%e7%97%85%e6%af%92%e7%bb%86%e8%83%9e%e5%90%b8%e9%99%84%e6%a8%a1%e5%9e%8b%e7%9a%84%e5%bb%ba%e7%ab%8b%e5%8f%8a%e7%97%85%e6%af%92%e5%90%b8%e9%99%84%e5%8c%ba%e5%9f%9f%e5%88%9d%e6%ad%a5%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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