根据商品化转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子 (CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子 (Nos)的序列特点 ,设计并合成了两对引物和相对应的荧光双链探针 ,建立一种应用荧光双链探针的多重荧光PCR同时检测转基因成分 35S启动子和Nos终止子的方法 .并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等 11份实物样品进行了检测 ,其中有 5份样品结果阳性 .结果表明所建立的多重荧光PCR方法能同时检测出 35S和Nos双组分 ,较常规PCR技术更为简便、快速、准确 ,有很好的应用前景 

刘光明

李庆阁

栾国彦

梁基选

王群力

苏文金

陈伟铃

Xiamen University Institutional Repository

第 41卷  第4 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol. 41  No. 4 2002年 7 月 Journal of Xiamen University (Natural Science) Jul. 2002 文章编号: 043820479(2002) 0420493205多重荧光 PCR同时检测转基因成分 35S和Nos方法的建立收稿日期: 2001206213基金项目: 厦门市科技计划资助项目( 3502Z2001109)作者简介:刘光明( 1972- ) ,男,在职博士研究生.刘光明1, 2,李庆阁1,王群力2,梁基选1,陈伟铃2,栾国彦1,苏文金1( 1. 厦门大学生命科学学院,福建 厦门 361005; 2. 厦门出入境检验检疫局, 福建 厦门 361012)摘要: 根据商品化转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(Nos)的序列特点,设计并合成了两对引物和相对应的荧光双链探针,建立一种应用荧光双链探针的多重荧光 PCR同时检测转基因成分 35S启动子和Nos终止子的方法.并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等 11 份实物样品进行了检测, 其中有 5份样品结果阳性. 结果表明所建立的多重荧光 PCR方法能同时检测出 35S和 Nos双组分, 较常规 PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景.关键词: 转基因食品;荧光双链探针;荧光 PCR;多重 PCR中图分类号: Q 78 文献标识码: A                  聚合酶链式反应( PCR)技术应用于转基因食品的检测,其敏感快速简便的特点是其它检测技术所无法比拟的.但存在的首要问题是基因高效扩增易造成 PCR产物的交叉污染, 从而可能导致假阳性结果;其次是不能进行基因定量检测[1] . 1995年出现的以标记特异性荧光探针为特点的实时荧光 PCR技术, 集 PCR 和探针杂交技术为一体, 直接探测PCR过程中的荧光变化, 可获得 DNA 模板的定量结果[2] .整个过程实行闭管式实时测定,扩增与检测同时完成,既简化了操作步骤又避免了扩增产物交叉污染, 提高了检测的特异性, 是目前最先进的 PCR技术.荧光双链探针是由两条反向互补的寡核苷酸链构成,两条链碱基分别与扩增的靶序列互补, 在探针的一条链上标记荧光剂, 另一条链上标记淬灭剂, 探针呈双链结构而使荧光剂和淬灭剂靠近, 二者发生荧光共振能量传递, 荧光被淬灭. PCR反应过程中,变性阶段的高温使探针两条链分开而发出荧光;退火阶段若无靶序列存在, 探针重新形成双链结构而不发荧光,此时若有扩增的靶序列产生,探针与靶序列特异性结合而发出荧光, 没有结合的多余探针仍然恢复双链状态;延伸阶段温度的升高使探针从靶序列上解离,引物继续延伸, PCR反应顺利进行.根据商品化转基因作物中常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(Nos)的序列特点,分别设计并合成了两对引物及相对应的荧光双链探针(两种探针上分别标记不同波长的荧光剂) , 建立了35S和Nos双组分的多重荧光 PCR检测方法.1  材料与方法1. 1  材  料样品及质粒来源:从厦门口岸入境的来自美国、加拿大、荷兰等国家的马铃薯、大豆、玉米的随机样,番茄、甜椒样品由厦门北大之路生物工程有限公司提供, 质粒 pCAMBIA1301和非转基因样品由厦门大学生命科学学院夏宁邵副研究员提供.主要仪器和试剂: iCycler iQTM实时荧光 PCR仪,CARY 3E紫外分光光度计. Taq酶、dNTP、RNase A等购自上海普洛麦格生物产品有限公司.引物和荧光双链探针: 35S 引物为 5.2GCT CCTACA AAT GCC ATC A23. 及 5. 2GAT AGT GGG ATTGTG CGT CA23. , Nos 引物为 5.2GAA TCC TGT TGCCGG TCT TG23. 及 5.2TTA TCC TAG TTT GCG CGCTA23. . 35S 荧光双链探针为 HEX25.2GAG GAG CATCGT GGA AAA AGA AG23. 及 5. 2TTT TCCACG ATGCTCCTC23. 2DABCYL, Nos荧光双链探针为 FAM25.2GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAT GGG T23. 及 5.2TCA TAA ATA ACG TCA TGC23. 2DABCYL. 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成.1. 2  方  法1) 样品DNA的提取采用改良 CTAB法[3] ,浓度测定采用紫外分光光度法.2) 两种荧光双链探针的变温曲线: 50 LL 变温反应液中含 10 mmol/L Tris2HCl( pH8. 0) , 1. 5mmol/ LMgCl2, 0. 2 Lmol/ L荧光双链探针, 从 40 e 开始, 每隔8 s温度升高 1 e ,反应至80 e 为止,每升高 1 e均采集荧光数据.3) 两种荧光双链探针的杂交曲线: 50 LL 杂交反应液中含10 mmol/L Tris2HCl( pH8. 6) , 3. 5 mmol/ LMgCl2, 0. 2 Lmol/L 荧光双链探针, 对应的探针靶序列终浓度为 0. 2 Lmol/ L, 94 e 预变性1 min,按 94 e变性 30 s、70 e (每循环 1次下降1 e ) / 60 s运行 33个循环,每次杂交均采集荧光数据.4) PCR扩增反应:( 1) 35S 启动子的 50 LL 扩增反应液中含 10mmol/ L Tris2HCl( pH8. 6) , 5. 5 mmol/ L MgCl2, 0. 2mmol/ L dNTP, 2. 0U Taq酶, 0. 4 Lmol/L 35S引物, 0. 2Lmol/ L 35S荧光双链探针, 5 LL模板 DNA;( 2) Nos 终止子的 50 LL 反应液中除含4. 5mmol/ L MgCl2, 0. 4 Lmol/L Nos引物, 0. 2 Lmol/ L Nos荧光双链探针外, 其余各成分同 35S 启动子的扩增反应液;( 3) 35S 和Nos双组分同时扩增的50 LL反应液中除含4. 5 mmol/ L MgCl2, 35S引物和 Nos引物各 0.4 Lmol/ L, 35S荧光双链探针和 Nos荧光双链探针各0. 2 Lmol/ L, 10 LL模板 DNA 外, 其余各成分同 35S启动子的扩增反应液;(4) 以上反应条件均为 94 e 预变性 5 min, 按94 e / 30 s、50 e / 60 s、72 e / 40 s运行40个循环, 72e 延伸5 min.荧光值的采集时间为退火后 30 s.5) 样品检测按 PCR扩增方法的反应液及反应条件分别对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等样品进行检测. 检测设立3份对照:无菌双蒸水(空白对照)、非转基因样品 DNA(阴性对照)和质粒 pCAMBIA1301(阳性对照) .2  结  果2. 1  样品 DNA提取结果经紫外分光光度法测定, 采用改良 CTAB法提取的样品 DNA的 OD260/ OD280为 1. 6~ 1. 8, DNA浓度为10~ 50 ng/ LL.2. 2  两种荧光双链探针的变温曲线作温度变性曲线的目的在于了解探针的热稳定性及 Tm值.结果显示两种探针在低于 50 e 时均为双链配对(荧光值< 5) , 其中 35S探针在 59 e 开始解链,荧光值随温度升高逐渐上升, 在 62~ 69 e 之间荧光值直线上升( 10~ 34) , 之后变化趋缓, 72 e时达到最大值( 36)后开始下降; Nos 探针则从 50 e开始解链,在 53~ 60 e 之间荧光值直线上升( 13~56) , 63 e 达到最大值( 60) . 结果表明, 两种探针从开始变性到完全解链均在一个较窄的温度范围内完成,为保持退火阶段采集荧光值时探针的双链配对,因而选择 50 e 作为多重荧光 PCR 同时检测双组分的退火温度.2. 3  两种荧光双链探针的杂交曲线将两种探针与对应靶序列分别做杂交曲线,结果显示在 70~ 58 e 的高温下探针的双链分离, 系统具有高而稳定的荧光值( 35S 探针为 19, Nos探针为34) .在 58~ 48 e 之间双链开始退火, 当系统中加有靶序列时,荧光标记链与靶序列结合,使系统仍保持高荧光值( 35S 探针为 15, Nos探针为 37) ;当系统中不含靶序列时,则探针的双链结合,使系统荧光值剧减( 35S探针为 4, Nos探针为 5) .2. 4  多重荧光 PCR检测方法的建立将阳性质粒模板稀释成 10- 1、10- 2、10- 3、10- 44个浓度梯度, 分别用两种探针及其相应的引物对质粒进行扩增反应, 由此得到荧光 PCR的动力学曲线(图 1, 2) . 由图可见随模板的稀释, 其荧光值上升呈梯度滞后,至反应后平台期产物量无显著差别. 以起始模板浓度为横坐标, 以刚进入指数增长期的起始点位置 ) 循环阈值( Ct )为纵坐标, 可以得到一条定量标准曲线(图 3) ,结果显示起始模板浓度与 Ct值之间呈良好的线性关系. 然后混和两对引物和两种探针对质粒进行双组分同时检测,结果表明,在同一#494# 厦门大学学报(自然科学版)                  2002年 图 1 荧光 PCR检测 35S启动子结果A: 10- 1稀释; B: 10- 2稀释; C: 10 - 3稀释; D: 10- 4稀释; E:空白 Fig. 1 Detection of 35S promoter in fluorescence PCR图 2  荧光 PCR检测 Nos终止子结果A: 10- 1稀释; B: 10- 2稀释; C: 10- 3稀释; D: 10- 4稀释; E:空白Fig. 2 Detection of Nos terminator in fluorescence PCR 图 3 35S及 Nos的荧光 PCR定量标准曲线 Fig. 3 Quantitative standard curve of 35S & Nos in fluorescencePCR 图 4  多重荧光 PCR同时检测 35S及 Nos双组分A:检测 35S启动子阳性结果( a为空白对照 ) ; B:检测Nos终止子阳性结果( b 为空白对照) Fig. 4  Detecting 35S & Nos simultaneously with multiplexfluorescence PCR管扩增反应中, 能以 35S 引物、Nos引物及其荧光双链探针的多重荧光 PCR 同时检测样品中的 35S 启动子和Nos终止子(图 4) .2. 5  样品检测结果应用建立的多重荧光 PCR 方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄共 11份实物样品进行检测, 结果显示马铃薯样品 2份及大豆、玉米、甜椒样品各 1份中检出 35S 和 Nos双组分, 另 6份样品均未检出(图 5, 6) .3  讨  论针对目前商品化转基因作物中大多数含有 35S启动子和Nos终止子的特点, 以及通常所用的荧光探针技术如 Taqman、分子信标 (Molecular beacon)等存在着制备复杂及荧光本底高的不足[ 4~ 6] , 分别设计了两对引物及其荧光双链探针,并将荧光双链探针技术应用于转基因成分 35S 和 Nos的快速检测中,这种新的探针技术设计及制备均较为简便, 并具有本底低及稳定性好的特点,它在保证灵敏度的同时,实现了对转基因成分的特异性检测.为保证PCR检测的顺利进行,提取纯化 DNA是整个研究的关键. 目前转基因食品 DNA的提取主要有 CTAB法和SDS 法.实验表明应用改良CTAB法提取样品基因组 DNA 具有简便、快速, 所获取的 DNA纯度优、得率高、完整性好,适用于大批量样品检验等特点.应用多重 PCR 技术同时对 35S 和 Nos 进行检测,该技术不仅提高了效率,而且由于是对双组分同时检测,其检测结果也更为可信. 此外, 根据欧盟转基因食品的阈值规定, 转基因食品的百分比是每一种转基因成分和同一物种的相对含量,因此,在转基因食品的定量检测中一般选用样品的内源基因(如#495#第 4期          刘光明等:多重荧光 PCR同时检测转基因成分 35S和 Nos方法的建立 图 5 多重荧光 PCR检测样品 35S启动子结果A2甜椒 G1; B2玉米 J1; C2薯条 J2; D2大豆 J1; E2阳性对照; F2薯条 J3;其余依次为番茄 G1 和 G2、马铃薯G1、甜椒 G2、玉米 J2、薯条 J1、阴性对照、空白对照 Fig. 5 Detection of samples with 35S promoter in multiplex fluo2rescence PCR 图 6  多重荧光 PCR检测样品 Nos终止子结果A2阳性对照; B2薯条 J3; C2大豆 J1; D2玉米 J1; E2薯条 J2; F2甜椒 G1;其余依次为番茄 G1和 G2、马铃薯G1、甜椒 G2、玉米 J2、薯条 J1、阴性对照、空白对照 Fig. 6 Detection of samples with Nos terminator in multiplexfluorescence PCR大豆的 Lectin基因、玉米的 Zein基因)作为内标[ 7] ,既可对结果进行定量分析又可避免假阴性结果. 为此,将在目前的基础上进一步应用荧光双链探针技术同时扩增 rbcL内标基因和 35S/ Nos双组分, 建立多重荧光 PCR定量检测转基因食品的新方法(另文发表) .应用建立的多重荧光 PCR方法同时检测了 11份实物样品,结果显示其中 5份样品检出了 35S 启动子和 Nos终止子, 其余 6份样品均未检出 (图 5,6) .该套方法整个过程仅需 4~ 6 h, 操作简便, 结果准确,适用于大豆、马铃薯、玉米等多种作物及其食品的检测与验证.结果还提示从厦门口岸进境的马铃薯、大豆、玉米中含有转基因产品,今后应加强该类产品的检验与管理.参考文献:[ 1]  Hardegger M, Brodmann P, Herrmann A. Quantitative de2tection of the 35S promoter and the Nos terminator usingquantitative competitive PCR[ J] . Eur Food Res Technol,1999, 209: 83- 87.[2]  Livak K J, Flood S J A, Mararo J, et al. Oligonucletideswith fluorescent dyes at opposite ends provide a quenchedprobe system useful for detecting PCR prod2  uct and nucleic acid hybridization[ J] . PCR Methods Applic,1995, 4: 357- 362.[ 3]  Markus L, Peter B, Klaus P, et al. IUPAC collaborative trialstudy of a method to detect genetically modified soy beansand maize in dried powder[ J] . Journal of AOAC Internation2al, 1999, 82( 4) : 923- 928.[4]  Ke L D, Chen Z, Yung WK. A reliability test of standard2based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards[ J] . Mol. Cell Probes, 2000, 14(2) : 127- 135.[5]  Becker K, Pan D, Whitely C B. Real2time quantitative poly2merase chain reaction to assess gene transfer [ J] . Hum.Gene Ther, 1999, 10: 2 559- 2 566.[6]  Whitcombe D, Browie J, Gillard H L, et al. A homogeneousfluorescence assay for PCR amplicons: its application to real2time, single2tube genotyping [ J] . Clin Chem, 1998, 44:918- 923.[7]  Anklam E, Gadani F, Heinze P, et al. Analytical methodsfor detection and determination of genetically modified organ2isms in agricultural crops and plant2derived food products[ J] . Eur Food Res Technol, 2002, 214: 3- 26.#496# 厦门大学学报(自然科学版)                  2002年Multiplex Fluorescence PCR Method for Detecting TransgenicComponent 35S and Nos SimultaneouslyLIU Guang2ming1, 2, LI Qing2ge1, WANGQun2li2, LIANG Ji2xuan1,CHEN Wei2ling2 , LUAN Guo2yan1, SUWen2jin1( 1. School of Life2Science, Xiamen University, Xiamen 361005, China;2. Xiamen Entry2Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361012, China)Abstract: The article is to establishMultiplex Fluorescence PCR (MF2PCR) method for detecting transgenic component35S promoter derived from Cauliflower Mosaic Virus and Nos terminator derived from Agrobacterium tumefaciens simulta2neously. According to the specific sequence of 35S and Nos which have been used in transgenic crops frequently, twopairs of primers and two pairs of corresponding fluorophore double2chain probes were designed and synthesized for detec2tion of 35S& Nos simultaneouslywith MF2PCR in a tube. 11 samples were tested with this method. The results showedthat 5 samples were positive, 6 samples were negat ive. The described methods enabled a sensitive、specific、simple andaccurate detection of geneticallymodified food and thus provide a useful tool for routine analysis of raw and processed foodproducts.Key words: genet ically modified food; fluorophore double2chain probe; fluorescence PCR; multiplex PCR#497#第 4期          刘光明等:多重荧光 PCR同时检测转基因成分 35S和 Nos方法的建立

多重荧光PCR同时检测转基因成分35S和Nos方法的建立

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21571/%e5%a4%9a%e9%87%8d%e8%8d%a7%e5%85%89PCR%e5%90%8c%e6%97%b6%e6%a3%80%e6%b5%8b%e8%bd%ac%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e6%88%90%e5%88%8635S%e5%92%8cNos%e6%96%b9%e6%b3%95%e7%9a%84%e5%bb%ba%e7%ab%8b.pdf?sequence=1&isAllowed=y

多重荧光PCR同时检测转基因成分35S和Nos方法的建立

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