目的对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究,评价检测能力及在国境口岸的应用价值。方法应用荧光PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离结核分枝杆菌,以传统药物敏感性试验为标准,获得该方法的灵敏性、特异性。结果对347例结核病人临床分离培养样本,传统药物敏感性试验检出271例利福平敏感标本,76例利福平耐药标本。荧光PCR熔解曲线法检出269例利福平敏感标本,78例利福平耐药标本,灵敏性为93.42%,特异性为97.42%,符合率为96.54%。结论荧光PCR熔解曲线法检测速度快速、灵敏度高、特异性强,可用于结核分枝杆菌利福平耐药突变的快速检测,适于国境口岸对耐多药结核病的快速筛查

李庆阁

李辉

李静

赵东阳

马艳艳

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中国国境卫生检疫杂志2011年12月第34卷第6期 Chinese Frontier Health Quarantine Dec.2011,Vol 34,No.6·实验研究与疾病监测·荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究马艳艳 1，李辉 2，赵东阳 2，李静 1，李庆阁 31.河南国际旅行卫生保健中心，河南 郑州 450016；2.河南省疾病预防控制中心;3.厦门大学生命科学学院生物医学科学系摘要：目的 对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究，评价检测能力及在国境口岸的应用价值。方法 应用荧光 PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离结核分枝杆菌，以传统药物敏感性试验为标准，获得该方法的灵敏性、特异性。结果 对 347例结核病人临床分离培养样本，传统药物敏感性试验检出 271例利福平敏感标本，76 例利福平耐药标本。荧光 PCR 熔解曲线法检出 269 例利福平敏感标本，78 例利福平耐药标本，灵敏性为 93.42%，特异性为 97.42%，符合率为 96.54%。结论 荧光PCR熔解曲线法检测速度快速、灵敏度高、特异性强，可用于结核分枝杆菌利福平耐药突变的快速检测，适于国境口岸对耐多药结核病的快速筛查。关键词：结核分枝杆菌；熔解曲线法；利福平；检测中图分类号：R52 文献标识码：BEvaluation of the mutations detection of rpoB gene inMycobacterium tuberculosis clinical isolates by probemelting analysis based real-time PCRMA Yan-yan，LI hui，ZHAO Dong-yang，LI Jing，LI Qing-geHenan International Travel Health Care Center, Zhengzhou, Heanan 450016,ChinaAbstract: Objective To evaluate the analysis abilities and valuation of the melting analysis based real-time PCR fordetecting the mutations of ropB gene in mycobacterium tuberculosis from clinical samples at frontier port. Methods Theprobe melting analysis assay was adopted for the sensitivity and specificity in detecting the isolates from clinical samplesagainst the standard of drug susceptibility testing (DST). Results A total of 347 mycobacterium tuberculosis isolates weredetected by two methods, in which, 271 rifampin sensitivity isolates and 76 rifampin resistant isolates were gained byDST. Meanwhile, 269 rifampin sensitivity isolates and 78 rifampin resistant isolates were gained by the probe meltinganalysis assay, the sensitivity and specificity of melting analysis assay was 93.42% and 97.42% , respectively. Theconcordance of the two methods was 96.54%. Conclusion The probe melting analysis assay own the characteristics ofshort-time, higher sensitivity and specificity for detecting rifampin resistance in tuberculosis using clinical sample and isavailable to use for rapid screening multidrug drug resistant tuberculosis at frontier ports.Key words: Mycobacterium tuberculosis; Melting analysis assay; Rifampin; Detect结核病是一种重要的传染病，据估计全球约有1/3的人感染，约10％的感染者成为结核病人。随着抗结核药物的使用，耐药结核病人逐渐增加，其中耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis, MDR-TB）[1]即至少同时对异烟肼和利福平（RIF）两种一线抗结核药物产生耐药的结核病人也逐年增加，高治疗成本、长治疗周期、低治愈率是 MDR-TB 的特点 [2,3]。2009年世界卫生组织报告统计，全球目前有 49万耐多药结核病患者，占结核病总患病人数的 5%[4]，而我国每年新发耐多药患者约 12万人[5]。国境口岸承担着出入境人员中结核病监控任务，要求对发现的结核病开展耐药的快速检测诊断，这对口岸实验室检测能力提出了更高要求。快速检测耐药结核病已经成为了结核病控制工作的关键，而随着对结核杆菌分子机理的认识和分子生物学技术的发展，发展了多种耐多药结核病的分子检测方法。荧光PCR探针熔解曲线法，以 rpoB 基因 81 bp 核心编码区作为靶序列，依据该靶序列熔点变化获得利福平耐药信息，实现对结核分枝杆菌利福平耐药性的检测。本研究对荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平·· 451中国国境卫生检疫杂志2011年12月第34卷第6期 Chinese Frontier Health Quarantine Dec.2011,Vol 34,No.6突变方法进行临床研究，以评价其检测能力及在国境口岸筛查耐多药结核病的价值。1 材料与方法1.1 材料 收集河南国际旅行卫生保健中心和河南省疾病预防控制中心筛查出痰涂片阳性肺结核病人的痰标本。1.2 方法1.2.1 分离培养 对收集的阳性肺结核病人的痰标本进行分离培养，痰标本分离培养按照《结核病诊断实验室检验规程》进行。1.2.2 比例法药物敏感性试验 对分离培养出的菌株进行结核分枝杆菌菌种鉴定并进行利福平药物敏感性试验，菌种鉴定使用对硝基苯甲酸(PNB)鉴别培养基和噻吩－2－羧酸肼（TCH）生长试验，利福平药物敏感性试验（40 μg/ml）为比例法，均按照《结核病诊断实验室检验规程》进行。1.2.3 探针熔解曲线法检测 RIF 耐药 按照荧光PCR探针熔解曲线法结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒(批号:10110401，厦门致善生物科技有限公司)说明书操作，固体培养基上生长的结核分枝杆菌，用标准接种环收集菌株 1 环，振荡悬在 250 μlTB DNA提取液中，99℃加热 20 min，14 000 g离心 10min，吸取 5 μl上清液，加入到含 20 μl PCR反应液的反应管中，放入 CFX96 实时荧光 PCR 扩增仪（USA，Bio-Rad）进行扩增和熔解分析。PCR 反应程序：尿嘧啶糖苷酶（UNG）去污染处理 50 ℃ 2 min，1个循环；预变性 95 ℃ 10 min，1 个循环；Touchdown 循环 95 ℃15 s，70 ℃ 20 s (每个循环下降 1℃)，13个循环；PCR循环 76 ℃ 25 s，95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，76 ℃ 25 s，42 个循环。熔解分析：95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，45℃~85℃（设置在此阶段每1℃采集FAM和TET通道荧光信号），1个循环。当样本的熔解温度(Tm)与阳性对照的 Tm一致(误差不超过 1℃)时判定为野生型；样本的Tm低于阳性对照2℃或2℃以上时判定为突变型。1.2.4 质量控制（1）进行比例法药物敏感性试验的实验室接受国家结核参比实验室的质量控制。（2）荧光 PCR 探针熔解曲线试验按照试剂盒说明书进行质量控制。（3）对探针熔解曲线法与比例法药物敏感性试验检测结果不一致的样本进行测序验证，用测序引物扩增包含 rpoB 待测区域的 350bp 的 DNA 片段，测序 引 物 为 ：上 游 引 物 5’-GGGAGCGGATGAC⁃CACCCA-3’和下游引物 rpoB-R：5’一 GCGGTACG⁃GCGTTTCGATGAAC-3’，测序由厦门大学分子诊断教育部工程研究中心进行。1.2.5 统计分析 使用 SPSS11.5统计软件建立数据库并进行统计分析。2 结 果2.1 比例法药物敏感性试验 共收集涂片阳性的肺结核病人350例，经分离培养，剔除污染和未生长菌株3株，共获得347株菌株，经鉴定均为结核分枝杆菌,其中271例为利福平敏感菌株，76例为利福平耐药菌株。2.2 探针熔解曲线法检测 获得的 347株临床分离结核分枝杆菌经探针熔解曲线法检测，其中 78株为利福平耐药株，269 株为利福平敏感菌株。ABCD 4个检测通道的典型熔解曲线结果如图1所示。2.3 灵敏性和特异性 探针熔解曲线法同比例法药物敏感性试验比较，灵敏度为 93.42％（71/76），特异性为 97.42％（264/271），阳性预测值为 91.03%，阴性预测值为98.14%（其中阳性为耐药，阴性为敏感），约登指数为0.91，总符合率为96.54%（表1）。-dF/dT0.80.40.050 60 70 80温度（℃）空白对照 突变型 野生型“dF/dT”表示荧光强度对温度的负倒数注：1:510 CAG→CAC突变型；2：CTG→CCG突变型，3：野生型（A）-dF/dT1.81.20.60.0-0.650 60 70 80温度（℃）空白对照 突变型 野生型“dF/dT”表示荧光强度对温度的负倒数注：1:516 CAG→TAC突变型；2：515GAC→GTC突变型，3：野生型（B）·· 452中国国境卫生检疫杂志2011年12月第34卷第6期 Chinese Frontier Health Quarantine Dec.2011,Vol 34,No.62.4 测序验证 对 12 株探针熔解曲线法与药物敏感性试验结果不一致的结核分枝杆菌菌株进行了测序，5株药物敏感性试验耐药而探针熔解曲线法检测敏感的菌株经测序，其中 4 株在 rpoB 核心区密码子从 507~534（共 81bp）未发生改变，为野生型菌株；1株因测序失败未得到结果；7株药物敏感性试验敏感而探针熔解曲线法检测耐药的菌株均发现了位点突变 ，2 株 531TCG→TTG，1 株 526CAC→AAC，1 株526CAC→AGC，1 株 526CAC→GGC，1 株 533CTG→CTA，1株533CTG→CCG（表2）。3 讨 论结核病耐药的分子检测方法基于对结核分枝杆菌的基因位点突变实现，结核分枝杆菌对药物的耐受性主要是基因位点突变引起的，不同基因位点的突变联系了不同的药物耐受。inhA，rpoB，rpsL/rrs，embB和gyrA 基因位点突变联系着异烟肼（INH）, 利福平（RIF），链霉素（SM），乙胺丁醇（EMB）和喹诺酮（Fluo⁃roquinolone）耐药[6]。通过检测突变的基因位点，就能得到结核分枝杆菌的耐药谱，其中编码RNA聚合酶β亚基的 rpoB 基因其 81bp 核心区突变可以在>95%耐RIF结核分枝杆菌中检测到[7]，rpoB基因突变是与RIF耐药高度相关的基因，结核分枝杆菌中检测出 rpoB基因突变即能表明该菌株耐RIF。同时，有研究表明耐RIF的菌株有90%的菌株同时耐 INH，使得 rpoB基因突变成为MDR-TB检测的标志性位点[8]。基于 rpoB基因突变检测耐利福平的方法有DNA微阵列芯片技术晶芯􀳏（中国，博奥）、线性探针膜杂交技术 GenoTypeMTBDRplus assay（德国，HAINS）以及荧光 PCR 探针熔解曲线法。DNA微阵列芯片和线性探针膜杂交技术可在 6～8个 h获得结果，但需要特殊仪器，操作步骤繁琐，对操作人员的技术要求高。而荧光PCR探针熔解曲线法在通用的荧光定量PCR仪上就能完成，不需要特殊的仪器设备，3 h内既可以获得检测结果。本研究使用的检测结核分枝杆菌耐利福平突变的荧光 PCR 探针熔解曲线法分为 2 个阶段，靶基因片段的扩增和扩增产物DNA的探针熔解分析。靶基-dF/dT0.80.40.0-0.450 60 70 80温度（℃）空白对照 突变型 野生型“dF/dT”表示荧光强度对温度的负倒数注：1:526 CAC→TAC突变型；2：523GGG→GTG突变型，3：野生型（C）-dF/dT1.20.60.0-0.650 60 70 80温度（℃）空白对照 突变型 野生型“dF/dT”表示荧光强度对温度的负倒数注：1:531 TCG→TGG突变型；2：531TCG→TTG突变型，3：野生型（D）图1 探针熔解曲线检测的典型结果表1 探针熔解曲线法与比例法药敏试验检测结核分枝杆菌耐药结果探针熔解曲线法耐药敏感合计比例法药物敏感性试验耐药71576敏感7264271合计78269347表2 探针熔解曲线法与药物敏感性试验检测结核分枝杆菌耐利福平不一致菌株测序结果样本编号9263020628367130154173255281332标本结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌结核分枝杆菌比例法药物敏感性试验耐药耐药耐药耐药耐药敏感敏感敏感敏感敏感敏感敏感探针熔解曲线法敏感敏感敏感敏感敏感耐药耐药耐药耐药耐药耐药耐药测序结果野生野生野生野生—526CAC→AAC526CAC→AGC533CTG→CTA533CTG→CCG531TCG→TTG531TCG→TTG526CAC→GGC注：“—”测序失败未得结果。·· 453中国国境卫生检疫杂志2011年12月第34卷第6期 Chinese Frontier Health Quarantine Dec.2011,Vol 34,No.6因片段的扩增阶段设计了分别标记不同荧光物质的4条探针，4条探针完全覆盖检测靶序列 ropB基因核心区的所有 8lbp碱基，且相邻探针末端有 2～3个碱基的重叠，从而保证了所有位置的突变均可得以检测[9]。扩增产物 DNA的探针熔解分析阶段利用探针与不同目标序列杂交能力的差异，探针与 PCR 扩增产物结合力的不同会导致Tm差异，即野生型基因具有特定熔点，基因发生突变能导致探针结合能力下降，熔点也会随之下降 2℃～10℃不等，根据熔解曲线的Tm变化就可判断突变的有无，实现对利福平耐药核心区野生型与突变型的特异区分和检测。研究中药物敏感性试验共检测出的 76 例利福平耐药标本，探针熔解曲线法检出了 71 例，灵敏度为 93.42%；未能检测出的 5份耐药标本，其中 4例经测序验证，这 4 例标本在利福平耐药 81bp 核心区未发现突变，这与探针熔解曲线法的检测结果相一致。4份标本显示的表型耐药可能因为是 81bp核心区外 DNA 序列发生突变引起的耐药或由于其他机制导致的耐药[10]。研究中271例药物敏感性结果为利福平敏感的标本中，探针熔解曲线法检出了263例敏感标本，另7例检测为利福平耐药，特异性为 97.42%；对 7例探针熔解曲线检测耐药的标本测序证实，2 例发生了531TCG→TTG类型突变，1例 526CAC→AAC类型突变，1例526CAC→AGC类型突变，1例526CAC→GGC类 型 突 变 ，1 例 533CTG→CTA 类 型 突 变 ，1 例533CTG→CCG类型突变，这些突变已有文献报道与利福平耐药相关[11]。531TCG→TTG类型突变通常判定为高耐药菌株[12]，533CTG→CCG在以往的研究中分别有低水平利福平耐药[13,14]和高水平利福平耐药的报道[15]；但因不同突变菌株个体在耐药水平上会存在差异及表型检测方法的不足，会存在基因检测发生了突变，但表型检测上可能显示不耐药或耐药水平很低。探针熔解曲线法与药物敏感性试验的总符合率为 96.54%，探针熔解曲线法和药物敏感性试验不符合的 11株菌株经对 81 bp ropB核心区测序，测序结果与熔解曲线法的结果一致，显示了探针熔解曲线方法检测利福平耐药突变有很高的准确性。探针熔解曲线法技术上采用了闭管法，检测样本和试剂一经混合于反应管中，直至获得结果，反应管不再打开，这使得检测过程中减少了扩增产物的污染。该方法也可以将PCR反应与探针熔解曲线分析分开完成，先在普通PCR仪器上扩增出产物，扩增产物再移至实时 PCR 仪器上进行探针熔解曲线分析，这样提高了操作的灵活性。本研究表明，荧光 PCR 探针熔解曲线检测结核分枝杆菌耐药突变在检测利福平耐药上有很高的灵敏性和特异性，且检测快速、操作简便，可应用于结核分枝杆菌分离培养标本的耐利福平检测,适用于国境口岸对耐多药结核病的快速筛查。参考文献[1] Alan R Hinman, James M Hughes, Dixie E Snider. 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荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21548/%e8%8d%a7%e5%85%89PCR%e6%8e%a2%e9%92%88%e7%86%94%e8%a7%a3%e6%9b%b2%e7%ba%bf%e6%b3%95%e6%a3%80%e6%b5%8b%e7%bb%93%e6%a0%b8%e5%88%86%e6%9e%9d%e6%9d%86%e8%8f%8c%e8%80%90%e5%88%a9%e7%a6%8f%e5%b9%b3%e7%aa%81%e5%8f%98%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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