目的研究油酰乙醇胺(OEA)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的抑制作用以及对p38信号通路的影响。方法分离大鼠胸主动脉,组织贴块法培养VSMCs,AngⅡ刺激VSMCs建立细胞增殖模型,不同浓度OEA(5,10,20μmol/L)作用后,用溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)掺入的方法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞周期变化;Western-bolt法检测对P-p38和p38蛋白表达的影响。结果与AngⅡ组比较,随着OEA浓度升高,VSMCs的增殖受到抑制、G0/G1比例显著升高,G2/M比例显著降低,且P-p38和p38蛋白的表达量降低并呈浓度依赖关系。结论 OEA对VSMCs的增殖有抑制作用,其机制可能是抑制了p38MAPK信号通路

张乐

田风

邹军

金鑫

魏晓

Xiamen University Institutional Repository

油酰乙醇胺对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响张 乐，邹 军，田 风，魏 晓，金 鑫( 厦门大学 医学院，福建 厦门 361005)摘 要: 目的 研究油酰乙醇胺( OEA) 对血管紧张素Ⅱ( AngⅡ) 刺激大鼠主动脉血管平滑肌细胞( VSMCs) 增殖的抑制作用以及对 p38 信号通路的影响。方法 分离大鼠胸主动脉，组织贴块法培养 VSMCs，Ang Ⅱ刺激 VSMCs建立细胞增殖模型，不同浓度 OEA( 5，10，20 μmol /L) 作用后，用溴脱氧核苷尿嘧啶( BrdU) 掺入的方法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞周期变化; Western-bolt法检测对 P-p38 和 p38 蛋白表达的影响。结果 与 AngⅡ组比较，随着 OEA浓度升高，VSMCs的增殖受到抑制、G0 /G1比例显著升高，G2 /M比例显著降低，且 P-p38 和 p38 蛋白的表达量降低并呈浓度依赖关系。结论 OEA对 VSMCs的增殖有抑制作用，其机制可能是抑制了 p38MAPK信号通路。关键词: 油酰乙醇胺; 平滑肌细胞; 增殖; p38; 血管紧张素Ⅱ中图分类号: R285． 5 文献标识码: A 文章编号: 1005-1678( 2012) 06-0709-04Inhibitory effect of oleoylethanolamide on proliferation of vascular smoothmuscle cells induced by angiotensin ⅡZHANG Le，ZOU Jun，TIAN Feng，WEI Xiao，JIN Xin( School of Medicine，Xiamen University，Xiamen 361005，China)Abstract: Purpose To investigate the inhibitory effect of oleoylethanolamide on the proliferation ofcultured rat vascular smooth muscle cells( VSMCs) induced by angiotensin Ⅱand the effect on p38 signa-ling pathway．Methods VSMCs were primary cultured by tissue sticking method． Cell proliferation modelwas established by stimulation with AngⅡ． After incubation with various concentrations of OEA( 5，10，20μmol / L) for 24 h，the proliferation effect was measured by using the BrdU cell proliferation assay kit． Cellcycle distribution was determined by flow cytometry analysis and the protein expression of P-p38 and p38was assessed using Western blotting． Results Compared with the AngⅡ group，along with the increasedconcentration of OEA，the proliferation of VSMCs was obviously inhibited，the cell ratio of G0 /G1 phaseobviously increased，and the cell ratio of G2 /M phase significantly decreased． Besides，the expression ofP-p38 and p38 protein decreased in a dose-dependent manner． Conclusion OEA had a inhibition on theproliferation of VSMCs，and might act by down-regulating p38MAPK pathway．Key words: oleoylethanolamide; vascular smooth muscle cells; proliferation; p38; angiotensin Ⅱ收稿日期: 2012-03-26基 金 项 目: 海 峡 ( 厦 门 ) 中 医 药 科 技 平 台 项 目( 3502Z20100006) ; 厦门市科技计划资助项目( 3502Z20090009)作者简介: 张 乐，女，硕士研究生; 金 鑫，男，通信作者，教授，从事心血管药理学研究，Tel: 0592-2188676，Email: xinjin@ xmu．edu． cn。血管平滑肌细胞( VSMCs) 的增殖和迁移是血管再狭窄和动脉粥样硬化发展形成过程中的重要部分［1］。过氧化增殖因子活化受体-α( PPAR-α) 与动脉粥样硬化的发生发展紧密相连，不仅是由于它跟脂质代谢、糖类代谢密切相关，而且还由于其抗炎和抗增殖作用［2］。油酰乙醇胺( OEA) 是一种天然的脂肪酸乙醇胺，已有研究表明，OEA 是 PPAR-α 的一个高亲和天然配体［3-4］。实验发现，OEA 可以通过激活 PPAR-α 受体从而发挥血管内皮的保护［5］、脑缺血的保护［6］和抗炎等多种作用，但是对细胞增殖方面作用，尚未见报道。因此本实验的主要内容是对 OEA 在动脉粥样硬化后期形成过程中主要的抗增殖作用进行体外研究。1 材 料OEA，自制; 非诺贝特、血管紧张素Ⅱ( AngⅡ) 、胰蛋白酶，美国 Sigma 公司; 二甲亚砜，上海生物工907中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2012 年第 33 卷第 6 期程技术服务有限公司; 胎牛血清，新西兰 Hyclone 公司; 低糖 DMEM 培养基，日本 GIBCO 公司; 小鼠抗大鼠 α-actin 单克隆抗体，武汉博士德生物工程公司; 溴脱氧核苷尿嘧啶( BrdU) 标记及检测试剂盒，德国 Roche 公司; 兔抗鼠 Phospho-p38 单克隆抗体、兔抗鼠 p38 单克隆抗体，美国 Cell Signaling 公司; 鼠抗人 β-actin 单克隆抗体，美国 Santa Cruz 公司; 羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗，美国 Muhisciences 公司。雄性 SD 大鼠，体重( 100 ± 5) g，上海斯莱克动物实验中心，许可证号: SCXK( 沪) 2007-0005。SpectraMax-M2 多功能 酶 标 仪，美 国 MolecularDevices 公司; 倒置荧光显微镜，日本 Nicon 公司;FACSCal ibur 型流式细胞仪，美国 BD 公司; KodakIS4000R 全自动图像工作站，美国 Kodak 公司。2 方 法2． 1 大鼠 VSMCs的培养和鉴定大鼠断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，洗去血液，去除外膜纤维脂肪组织，用眼科剪纵行剪开血管，刀片刮血管内膜 2 ～ 3 遍，然后将血管切成约 1mm2大小碎片，分装贴入培养瓶中，加入含 10%小牛血清的 DMEM 培养基，倒置 3 ～ 4 h 后翻转，于 37℃，5% CO2 的细胞培养箱中静置 3 d，每 2 天换液。4 ～ 7 d 平滑肌细胞从组织块中爬出，2 ～ 3 周出现致密细胞层。待细胞快融合时用 0． 25% 胰蛋白酶消化传代，取 3 ～ 8 代细胞做实验。在倒置显微镜下观察及 α-actin 单 克 隆 抗 体，通 过 免 疫 组 化 法 鉴 定VSMCs 的特异性肌动蛋白。2． 2 BrdU-ELISA 法检测以细胞数 10 000 /孔接种 96 孔板培养 48 h 后，观察细胞生长状态良好，换无血清培养液，24 h 同步化后，加入不同浓度的 OEA ( 分别为 5，10 及 20μmol /L) 和非诺贝特 100 μmol /L，1 h 后再加入 AngⅡ100 nmol /L，共同培养 24 h 后，每孔加入 BrdU 10μL 标记细胞，37 ℃孵育 2 h，弃培养液。经 60 ℃干燥 1 h，FixDenat 固定液室温固定 30 min。弃固定液加入 Anti-BrdU-POD 液室温放置 90 min，吸弃抗体加洗涤工作液洗涤，每孔 3 次。加 底 物 溶 液 100μL，室温放置 30 min。每孔加终止反应液( 1 mol /LH2SO4 ) 25 μL，5 min 内自动酶标仪测定，λ ( 测) =450 nm，λ( 参) = 690 nm。2． 3 细胞周期测定将细胞接种于 6 孔培养板，37 ℃孵育 24 h 后换无血清培养液，将细胞阻滞在 G0 /G1 期。48 h 后换2%低血清培养液，分为正常组、AngⅡ组、不同浓度的 OEA 组和非诺贝特组，将细胞置 37 ℃继续培养36 h，经碘化丙锭染色后，用流式细胞仪自动计数10 000个细胞，流式细胞仪测定细胞周期构成比。2． 4 Western blotting 检测取 VSMCs 细胞，以细胞数 1 × 105 个 /mL 接种 6孔板中，置于 37 ℃、5%CO2 培养箱内培养。细胞生长近融合后，弃上清液，以无血清高糖 DMEM 为空白对照，分别加入含不同浓度的 OEA 和非诺贝特培养基培养 1 h 后，AngⅡ刺激 5 min，提取蛋白。用改良型 RIPA 细胞裂解液，冰浴裂解细胞 30 min，BCA方法测定细胞总蛋白浓度，按常规方法进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜并封闭后，分别加入 P-p38、p38、GAPDH 单克隆抗体( 1∶1 000) 1 mL，4 ℃过夜。再加入二抗( 1∶1 000 ) 1 mL，室温孵 1 h，洗膜、使用Kodak IS4000R 全自动图像工作站，检测、拍照，分析条带灰度值。2． 5 统计学分析采用 Graphpad Prism 5 ( GraphPad Software Inc，USA) 软件进行分析，所有数据以( x ± s) 表示，两组间样本均数比较采用 t 检验。3 结 果3． 1 OEA对 AngⅡ诱导的 VSMCs增殖的影响不同浓度的 OEA 和非诺贝特作用 1 h 后，给予Ang Ⅱ刺激，24 h 后检测细胞增殖，结果显示 OEA可以剂量依耐性抑制 VSMCs 增殖，并在 20 μmol /L浓度作用最好，见表 1。表 1 OEA 对 AngⅡ诱导的 VSMCs 增殖的影响( n =6，x ± s)Tab． 1 Effects of OEA on Ang Ⅱ induced rat VSMCs prolifera-tion( n = 6，x ± s)组 别剂量/ ( μmol / L)A 值正常对照组AngⅡ组OEA 组非诺贝特组－100 ng /mL510201000． 577 ± 0． 17210． 920 ± 0． 1500． 852 ± 0． 1970． 744 ± 0． 1530． 576 ± 0． 13420． 648 ± 0． 1412与 AngⅡ组比较: 1P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 011P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 01 vs AngⅡ group3． 2 OEA 对 Ang Ⅱ诱导的 VSMCs周期的影响不同浓度的 OEA 和非诺贝特与 Ang Ⅱ共同作用 36 h，可以影响 VSMCs 细胞周期分布使 G0 /G1期细胞比例增高，S 期细胞比例降低，G2 /M 期比例降低，特别浓度在 20 μmol /L 的 OEA 作用效果最好 ，与阴性对照组相比差异有显著性( P ＜ 0． 05) ，结017 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2012 年第 33 卷第 6 期表 2 OEA 对 VSMCs 周期的影响( n = 6，x ± s)Tab． 2 Effects of OEA on cell cycle of VMSCs( n = 6，x ± s)组 别剂量/ ( μmol / L)G0 /G1 期/%S 期/%G2 /M 期/%正常对照组 － 79． 17 ± 1． 661 9． 46 ± 0． 72 11． 37 ± 1． 911AngⅡ组 100 ng /mL 69． 33 ± 1． 01 8． 05 ± 0． 67 22． 62 ± 0． 74OEA 组 5 70． 38 ± 1． 25 8． 33 ± 0． 23 21． 29 ± 1． 0510 74． 74 ± 1． 29 8． 69 ± 0． 36 16． 57 ± 1． 3120 77． 97 ± 1． 031 9． 09 ± 0． 39 12． 95 ± 1． 061非诺贝特组 100 75． 05 ± 1． 312 8． 78 ± 0． 48 16． 17 ± 1． 282与 AngⅡ组比较: 1P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 011P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 01 vs AngⅡ group果见表 2。表明 OEA 将平滑肌细胞细胞周期阻滞于 G0 /G1 期，从而抑制平滑肌细胞增殖。3． 3 OEA对 Ang Ⅱ诱导的 VSMCs P-p38 和 p38 蛋白的影响与对照组相比，Ang Ⅱ诱导后 P-p38 的表达明显增加( P ＜ 0． 001 ) ，加入 OEA，P-p38 的表达呈一定的剂量依赖性减少，其中 20 μmol /L OEA 对 P-p38 的下调作用最明显，作用好于 100 μmol /L 非诺贝特，见表 3 和图 1A。同样，Ang Ⅱ诱导后，p38 的表达增加( P ＜ 0． 05 ) ，给予 OEA 或非诺贝特干预后，p38 的表达下调，见图 1B。表 3 OEA 对 VSMCs P-p38 和 p38 蛋白表达的影响( n = 4，x± s)Tab． 3 Effects of OEA on protein expression of P-p38 and p38in VMSCs( n = 4，x ± s)组 别剂量/ ( μmol / L)蛋白的表达量 /%P-p38 p38正常对照组 － 47． 07 ± 13． 593 77． 80 ± 9． 101AngⅡ组 100 ng /mL 100 100OEA 组 5 75． 65 ± 14． 96 81． 15 ± 11． 4210 66． 54 ± 17． 531 78． 54 ± 7． 11120 58． 63 ± 11． 882 70． 88 ± 12． 832非诺贝特组 100 67． 88 ± 7． 651 75． 86 ± 5． 921与 AngⅡ组比较: 1P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 01，3P ＜ 0． 0011P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 01，3P ＜ 0． 001 vs AngⅡ group4 讨 论VSMCs 异常增殖是许多心血管疾病的共同病理过程，在众多促生长因子中，Ang Ⅱ已成为当前研究的热点。Ang Ⅱ是肾素-血管紧张素系统的主要活性物质，与 VSMCs 上其 1 型受体( Angiotensin type1 recepto r，AT1R) 结合后，可经丝裂原激动蛋白激酶( mitogen activated protein kinase，MAPK) 、核因子-B( NF-κB) 等多条信号通路，启动 VSMCs 的增殖和迁移。其中 p38MAPK 信号转导通路是 MAPK 通路一个重要分支，它在炎症、应激、凋亡、细胞周期和生1． 对照组; 2． AngⅡ 诱导组; 3 ～ 5． 5，10，20 μmol /L OEA; 6． 100μmol /L 非诺贝特1． Control; 2． AngⅡ stimulation group; 3-5． Treatment with 5，10，20μmol /L OEAⅡ; 6． Treatment with 100 μmol /L Fenofibrate图 1 OEA 对 VSMCs 中 P-p38( A) 和 p38( B) 蛋白表达的影响Fig． 1 Effects of OEA on protein expression of P-p38 ( A) andp38( B) in VSMCs长等多 种 生 理 和 病 理 过 程 中 发 挥 重 要 作 用［7-9］。MKK3 与 MKK6 是公认的 p38 上级激酶，它们通过直接磷酸化络氨酸、丝氨酸 /苏氨酸残基激活 p38，作用与 GADD153、c-myc 等下游靶基因［10］，控制多种转录因子的基因表达活性，如激活作用转录因子、生长停滞及 DNA 损伤基因、核因子 NF-κB 等。OEA 作为一个重要的体内脂质调节因子，通过激活 PPAR-α 起到调节脂质、糖类代谢的作用。已有研究发现，PPAR-α 可以抑制单核细胞转化为巨噬细胞，抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，抑制泡沫细胞的形成等［11-12］。PPAR-α 的激动剂能够调 节p38MAPK 信号通路上调 PPAR-α 表达，诱导 VSMCs凋亡［13］。Gizard 等［14］认为，PPAR-α 可以通过诱导细胞素依赖性激酶抑制子 p16，阻断细胞周期中 G1到 S 期 的 转 变，抑 制 VSMCs 的 增 殖，这 可 能 是PPAR-α 影响动脉粥样硬化的发生发展和再狭窄的进程作用之一。本研究中，Ang Ⅱ诱导 VSMCs 增殖周期 从 G0 /G1 期 向 S 期、G2 /M 期 转 化，刺 激VSMCs 增殖，同时增强 P-p38 和 p38 蛋白表达。然而，5 ～ 20 μmol /L 的 OEA 能够阻止 VSMCs 向 S 期、117中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2012 年第 33 卷第 6 期G2 /M 期转化，显著抑制 VSMCs 增殖，降低 P-p38 和p38 表达，且具有浓度依耐性。因此推测 OEA 能使细胞周期中静止和分裂前期的细胞显著增多，从而抑制 VSMCs 的增殖，且抗增殖的作用至少部分是由p38MAPK 途径表达介导，至于 OEA 参与 p38MAPK信号通路表达的分子机制尚不清楚，有待进一步研究。综上所述，OEA 至少部分通过调节 p38 MAPK信号通路，从而抑制 AngⅡ诱导的 VSMC 增殖，发挥血管保护作用。本文加深对 PPAR-α 在动脉粥样硬化中作用的认识，并为该药的临床应用提供了理论依据。参考文献:［1］ Schmidt-Ott K M，Kagiyama S，Phillips M I． The multiple actions ofangiotensinⅡ in atherosclerosis［J］． Regul Peptides，2000，93 ( 1-3) : 65-77．［2］ Lefebvre P，Chinetti G，Stael B，et al． Sorting out the roles of PPAR-α in energy metabolism and vascular homeostasis［J］． J Clin In-vest，2006，116( 3) : 571-579．［3］ Fu J，Oveisi F，Gaetani S，et al． Oleoylethanolamide，an endogenousPPAR-α agonist，lowers body weight and hyperlipidemia in obeserats［J］． Neuropharmacology，2005，48( 8) : 1147-1153．［4］ Guzman M，Lo V J，Fu J，et al． Oleoylethanolamide stimulates lipol-ysis by activating the nuclear receptor peroxisome proliferator-acti-vated receptor alpha ( PPAR-alpha) ［J］． J Biol Chem，2004，279( 27) : 27849-27854．［5］ 秦 文，金 鑫，陈彩霞，等． 油酰乙醇胺对人脐静脉内皮细胞血管细胞 黏 附 分 子-表 达 的 影 响［J］． 中 国 生 化 药 物 杂 志，2008，29( 6) : 374-377．［6］ 杨立朝，杨武双，周 宇，等． 油酰乙醇胺对小鼠局灶性脑缺血的保护作用［J］． 中国药理学通报，2009( 9) : 1219-1223．［7］ Bao X M，W u C F，Lu G P． Atorvastatin attenuates homocysteine-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells via in-hibiting NADPH oxidase-related oxidative stress-triggered p38MAPK signaling［J］． Acta Pharmacol Sin，2009，30 ( 10 ) : 1392-1398．［8］ Ho T C，Chen S L，Yang Y C，et al． Cytosolic phospholipase A2-al-pha is an early apoptotic activator in PEDF-induced endothelialcell apoptosis［J］． Am J Physiol Cell Physiol，2009，296 ( 2 ) :C273-284．［9］ Wang X H，Xu B，Liu J T，et al． Effect of beta-escin sodium on en-dothelial cells pro liferation，migration and apoptosis［J］． VasculPharmacol，2008，49( 4-6) : 158-165．［10］ Enslen H，Raingeaud J，Davis R J． Selective activation of p38 mito-gen-activated protein( MAP ) kinase isoforms by the MAP kinasekinases MKK3 and MKK6［J］． J Biol Chem，1998，273( 3) : 1741-1748．［11］ Zapolska Downal D，Siennicka A，Kaczmarczyk M，et al． Butyrateinhibits cytokine-induced VCAM-1 and ICAM-1 expression in cul-tured endothelial cells: the role of NF-κB and PPAR-α［J］． J NutrBiochem，2004，15( 4) : 220-228．［12］ Wang Y，Wang Y，Yang Q，et al． Effects of bezafibrate on the ex-pression of endothelial nitric oxide synthase gene and its mecha-nisms in cultured bovine endothelial cells［J］． Atherosclerosis，2006，187( 2) : 265-273．［13］ Diep Q N，Touyz R M，Schiffrin E L． Docosahexaenoic acid，a per-oxisome proliferator-activated receptor-α ligand，induces apoptosisin vascular smooth muscle cells by stimulation of p38 mitogen-acti-vated protein kinase hypertension［J］． 2000，36( 5) : 851-855．［14］ Gizard F，Amant C，Barbier O，et al． PPARα inhibits vascularsmooth muscle cell proliferation underlying intimal hyperplasia byinducing the tumor suppressor p16INK4a［J］． J Clin Invest，2005，115( 11) : 3228-3238．( 上接第 708 页)［5］ Zheng J，Zheng P，Zhou X，et al． Relaxant effects of matrine onaortic smooth muscles of guinea pigs［J］． Biomed Environ Sci，2009，22( 4) : 327-332．［6］ 王铁军，李绍平，简家荣，等． 苦参碱抗肿瘤作用研究进展［J］．中国实验方剂学杂志，2004，10( 4) : 52-55．［7］ Wan X Y，Luo M ，Li X D，et al． Hepatoprotective and anti-hepa-tocarcinogenic effects of glycyrrhizin and matrine［J］． Chem BiolInteract，2009，181( 1) : 15-19．［8］ 常 青，张冬青，李小翠，等． 苦参碱脂质体抗乙型肝炎病毒的体外实验研究［J］． 热带医学杂志，2003，3( 1) : 19-21．［9］ 中国药典［S］． 二部． 2010: 附录 XIXD．［10］ Wang F Q，Li P，Zhang J P，et al． A novel pH sensitive magneticalginate-chitosan beads for albendazole delivery［J］． Drug Dev IndPharma，2010，36( 7) : 867-877．［11］ Liu H J，Li P，Wei Q． Magnetic N-succinyl chitosan /alginatebeads for carbamazepine delivery［J］． Drug Dev Ind Pharm，2010，36( 11) : 1286-1294．［12］ 王家远，杨 波，赵榆林，等． 壳聚糖-三七总皂苷缓释微囊的制备及体外溶出研究［J］． 中国药业，2006，15( 17) : 28-29．217 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2012 年第 33 卷第 6 期

油酰乙醇胺对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

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