以二甲亚砜(DMSO)为效应物,研究其对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明,酶的剩余活力随着DMSO浓度增高而迅速下降,当DMSO浓度达4.0 mol/dm3时,酶活力几乎完全丧失.该酶在低于2 mol/dm3的DM-SO溶液中的失活作用表现为可逆过程.导致酶活力丧失50%的DMSO浓度(IC50)为0.75 mol/dm3.应用酶失活过程的底物反应动力学方法测定了游离酶(E)和酶-底物络合物(ES)在不同浓度DMSO溶液中的微观失活速度常数k+0和k+′0,k+0明显大于k+′0,说明游离酶较酶-底物络合物对DMSO更为敏感,底物对酶被DMSO失活有保护作用.随着DMSO浓度增加,逆向微观复活速度常数k-0不断下降,这说明NAGase在高浓度DMSO中失活的可逆性减弱

张继平

陈清西

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第 25卷  第 1期 台 湾 海 峡 Vo.l 25,  No. 1 2006年 2月 JOURNAL OF OCEANOGRAPHY IN TA IWAN STRA IT Feb. , 2006收稿日期: 2005-05-26基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 40576066 );厦门大学科技创新工程基金资助项目 (XDKJCX20043001)作者简介:张继平 ( 1972~ ) ,男,博士研究生.通讯作者:陈清西,男,教授 (博导 ); T el/Fax: 0592-2185487, E-m ai:l chenqx@ jingxian. xm u. edu. cn锯缘青蟹 NAGase在 DMSO溶液中的失活动力学张继平1, 2,陈清西1( 1. 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室、厦门大学生命科学学院,福建 厦门  361005;2.佛山科学技术学院生命科学学院, 广东 佛山  528231)摘要:以二甲亚砜 ( DM SO )为效应物, 研究其对锯缘青蟹 N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明,酶的剩余活力随着 DMSO浓度增高而迅速下降,当DMSO浓度达 4. 0 mol /dm3时,酶活力几乎完全丧失. 该酶在低于 2 mo l/dm3的 DM-SO溶液中的失活作用表现为可逆过程.导致酶活力丧失 50%的 DMSO浓度 ( IC50 )为0. 75mo l/dm3. 应用酶失活过程的底物反应动力学方法测定了游离酶 ( E )和酶-底物络合物 ( ES)在不同浓度 DMSO溶液中的微观失活速度常数 k+ 0和 kc+ 0, k+ 0明显大于kc+ 0,说明游离酶较酶-底物络合物对 DMSO更为敏感, 底物对酶被 DMSO失活有保护作用.随着 DMSO浓度增加,逆向微观复活速度常数 k- 0不断下降, 这说明 NAGase在高浓度 DMSO中失活的可逆性减弱.关键词:海洋生物; N-乙酰-B-D氨基葡萄糖苷酶;实验研究;锯缘青蟹;二甲亚砜;失活动力学中图分类号: Q556. 1     文献标识码: A      文章编号: 1000-8160( 2006) 01-0019-06锯缘青蟹 (Scy lla serrata )属于甲壳纲、十足目、短尾亚目、梭子蟹科. 其个体大、生长快、适应性较强,且营养丰富,具有较高的商品价值, 是我国沿海重要的海洋经济蟹类之一. 其养殖面积逐年增加,养殖由粗放型向集约化养殖方向发展. 但由于病原体的侵蚀扰乱、环境的污染(水体中的重金属离子、有机化合物 )都将引起锯缘青蟹体内的生理生化变化, 影响其正常生理活动与物质代谢,导致锯缘青蟹的健康程度下降,疾病的发生日益增多[ 1],严重制约了我国养蟹业的发展.N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷酶 ( EC 31211152,简称 NAGase)广泛存在于海洋甲壳动物中,能将较长链的壳聚糖降解成短链或单糖. 它直接参与甲壳动物生长发育中的周期性蜕皮[ 2, 3].甲壳动物很多疾病都与其蜕皮生理状态发生的病理性改变有关.因此, 研究该酶对于锯缘青蟹的养殖具有重要意义.在分离纯化锯缘青蟹 NAGase并研究酶的部分性质的基础上, 为了进一步研究水体难溶的有机污染物对该酶活力的影响,我们有必要先探讨作为有机物良好媒介溶剂的二甲亚砜 (简称 DMSO )对锯缘青蟹 NAG ase的影响, 并采用 Tsou( 1998)介绍的方法[ 4]研究该酶在 DMSO溶液中的失活动力学.通过建立酶在该溶液中失活作用的动力学模型, 分析测定了游离酶 ( E )和结合酶 ( ES)的微观失活速度常数, 为进一步研究有机污染物对锯缘青蟹NAGase的影响提供了理论基础.台 湾 海 峡 25卷1 材料与方法111 材料对硝基苯-N-乙酰-B-D-氨基葡萄糖苷 ( pNP-NAG )为上海医药工业公司产品; 对硝基苯酚( pNP)、二甲亚砜 ( DM SO )为 S igm a公司产品. 锯缘青蟹 NAG ase酶制剂参考文献 [ 3]方法制备,获得 PAGE和 SDS-PAGE为单一蛋白带的酶制剂, 纯酶的比活力为 7 990U /mg. 其他试剂为国产分析纯试剂,所用试剂均用去离子水配制.112 方法11211 酶促反应动力学参数 (Km、vm )的测定  以 pNP-NAG为底物, 在 210cm30105mo l/dm3N aAc-HA c缓冲体系 ( pH = 518)中, 改变底物浓度, 于 37e 下加入 10mm 3酶液, 在 BeckmanDU-650分光光度计上跟踪波长为 405 nm的吸光值随反应时间的变化直线,从直线斜率计算酶促反应的初速度 vm. 产物 ( pNP)的摩尔消光系数测定结果为 1177 @ 103dm3/ (mo l# cm ).11212 DMSO对酶活力的影响  在 210cm3的测活体系中 (其包含 012mmo l/dm 3底物和0105mol /dm3 NaA c-HA c缓冲液, pH = 518) , 加入不同浓度的 DMSO, 在 37e 恒温下, 加入10mm3酶液,准确反应 10 m in后, 加入 210 cm3 015mo l /dm3 NaOH终止反应. 在 Beckman DU-650分光光度计上测定波长为 405nm的吸光值, 以不加 DMSO的为对照,计算酶的相对活力.DM SO对酶的失活程度以导致酶活力下降 50%的失活剂浓度 ( IC50 )来衡量.对该酶在 DMSO溶液中失活作用机理的判断采用文献 [ 5]的方法,即在含不同浓度 DMSO的测活体系中,测定不同浓度的酶量与酶活力的关系图.11213 酶失活动力学分析  参考文献 [ 6, 7] ,采用酶在失活过程中的底物反应动力学方法来分析测定该酶在 DMSO溶液中的失活动力学.2 实验结果211 NAGase水解 pNP-NAG动力学参数的测定在测活体系中,改变底物浓度,于 37e 下加入 10mm3酶液, 在 Beckm anDU-650分光光度计上跟踪波长为 405nm的吸光值随反应时间的增长直线, 从直线斜率计算出酶促反应的初速度 ( v0 ). 用 L inew eaver-Burk双倒数法作图, 可求得该酶催化 pNP-NAG水解的米氏常数 (K m )值为 01394 ? 01012mmo l/dm3,最大反应速度 (vm )值为 13158 ? 0132 Lmol/ ( dm3 #m in) ,见图 1.212 DMSO对酶活力的影响以 DMSO为效应物, 在测活体系中加入不同浓度 DMSO, 研究其对锯缘青蟹 NAGase活力的影响,结果见图 2.随着 DMSO浓度增高,酶活力迅速下降,导致酶活力下降一半所需的#20# 1期 张继平,陈清西: 锯缘青蟹 NAGase在 DM SO溶液中的失活动力学DMSO浓度 ( IC50 )为 0175mo l/dm3. 当 DMSO浓度达到 410 mo l/dm 3时,酶活力丧失 97%, 说明高浓度 DMSO对锯缘青蟹 NAGase有明显的失活作用.213 酶在 DMSO溶液中的失活作用表现为可逆过程在测活体系中,固定 pNP-NAG浓度为 012 mol /dm3,加入不同浓度的 DMSO, 改变加入的酶量, 测定酶催化反应的活力. 以剩余酶活力对加入酶的浓度作图 (图 3, 直线 1~ 5的 DMSO浓度分别为: 0、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6mo l/dm3,底物浓度为 0. 4mmol /dm3),结果得到一组通过原点的直线,随着 DMSO浓度增高,直线的斜率逐渐降低.这说明酶在 DMSO溶液中的失活作用是可逆的反应,因为不可逆的作用将会导致有效酶量下降而产生一组平行线.214 酶在不同浓度 DMSO溶液中的失活动力学过程酶在含不同浓度 DMSO的测活体系中,监测产物的形成量与反应时间的关系. 图 4a显示酶催化 014mmo l/dm 3 pNP-NAG水解反应的动力学过程.在各种 DMSO浓度下,产物形成的速率随着反应时间的延长而逐渐下降直到一条稳定斜率的直线. 这说明在各种 DMSO浓度下,酶还保留一定的剩余活力.该直线的斜率随着 DMSO浓度的增大而下降, 进一步显示该酶在低浓度 DMSO溶液中的失活作用是一种可逆过程.以 ln( [ p] calc- [ p] t )对时间 ( t )作图为直线(图 4b), 从直线斜率可以求出表观失活速度常数.图 4中 OD为光密度值, [ p] t为 t时刻产物形成量的实测值, [ p] calc为 t时刻产物形成量的计算值.215 酶在 DMSO溶液中的失活微观速度常数的测定在含不同浓度 DMSO的测活体系中,分别测定酶催化不同浓度底物反应的动力学. 图 5a为酶在含 014mo l/dm3 DMSO测活体系中催化不同底物浓度水解的动力学曲线. 根据文献[ 6, 7]方法,以 ln( [ p] ca lc-[ p] t )对 t作图为一组直线 (图 5b) , 从直线的斜率可以求得表观失活速度常数 A.以 [ p] calc对反应时间 t作图为一组直线,从直线的斜率求得失活逆反应的速度常数 k-0值,结果列于表 1.以 A /v对 1 / [ s]作图为一条直线 (图 5c) .从直线的斜率和截距分别可以求得游离酶的正向微观失活速度常数 k+ 0及结合酶的失活速度常数, 其测定结果也列于#21#台 湾 海 峡 25卷表 1.酶在其他浓度的 DMSO溶液中的微观失活速度常数也可以同样的方法求得,结果均列于表 1.表 1 锯缘青蟹 NAGase在 DMSO溶液中的失活速度常数Tab. 1 Inactivation rate constants of green crab NAGase in DM SO so lutionDM SO浓度( mo l/dm3 )失活速度常数( 10- 3m in- 1 )k+ 0 k- 0 kc+ 0剩余酶活力(% )0 0 0 0 100. 00. 2 21. 77 2. 127 6. 278 83. 6 ? 0. 20. 4 66. 88 2. 012 7. 830 68. 1 ? 0. 10. 8 72. 51 1. 732 9. 100 46. 2 ? 0. 31. 6 77. 60 0. 907 21. 63 21. 1 ? 0. 23 讨论DMSO作为一种公认的有机物与水的媒介溶剂,在医药、农业、化妆品等研究与生产中得到了广泛的应用[ 8].在酶学研究中, DM SO本身作为一种有机物, 在低浓度时通常对酶的影响很小, 如蘑菇酪氨酸酶在 0170mol /dm3的 DMSO溶液中活力仍可以保持在 95%以上 [ 7 ] .本文的研究结果表明,锯缘青蟹 NAG ase在 011mo l/dm3DMSO的溶液中,剩余活力可保持在 92%;DM SO浓度达到 012mo l/dm3时,酶的剩余活力只保持在 8315%; 随着 DMSO浓度的进一步增高, 酶的剩余活力进一步下降. 这说明锯缘青蟹 NAGase比蘑菇酪氨酸酶对 DMSO更加敏感.因此,在研究有机物对锯缘青蟹 NAGase的影响时,如要采用 DMSO作溶剂, 溶剂的浓度应控制在 011mo l/dm3以下比较适宜. T sou( 1998)的不可逆动力学方法 [ 4]已被拓展来研究酶的可逆抑制作用和失活作用.例如,在锯缘青蟹碱性磷酸酶[ 9]、福寿螺 ( Ampullarium crosseam ) N-乙酰氨基葡萄糖苷酶[ 7]等的盐酸胍失活动力学,以及在凡纳滨对虾 ( L itop enaeus vannamei) NA-G ase在二氧六环中的失活动力学研究[ 10 ]中,均获得满意的实验结果.在本文中, 我们建立了锯缘青蟹 NAGase在 DMSO溶液中的失活作用的动力学模型.酶在 DMSO溶液中的失活作用动力学显示游离酶的正向微观失活速度常数是酶-底物络合物的失活速度常数的 3~ 8倍,表明#22# 1期 张继平,陈清西: 锯缘青蟹 NAGase在 DM SO溶液中的失活动力学游离酶比结合酶更容易失活. 此外, 正向反应的微观失活速度常数随着 DMSO浓度的增高而增大, 说明其变性越来越快;逆向反应的微观速度常数相反地随着 DMSO浓度的增高越来越小,表明酶复活的能力越来越低.该研究结果表明 Tsou( 1998)提出的底物反应过程中测定酶的不可逆失活作用动力学方法[ 4 ],也同样适合于研究其可逆失活作用.参考文献:[ 1]  徐海圣, 舒妙安, 邵庆均, 等. 锯缘青蟹常见病害及其防治技术 [ J].水产科学, 2000, 19( 5): 24~ 26.[ 2]  Funke B, Sp ind le r K D. Charac teriza tion o f chitinase from the brine shr imp artem ia[ J]. Com p B iochemPhysio,l 1989, 94B ( 4): 691~ 695.[ 3]  Kono M, M atsui T, Sh im izu C, et al. Pur ifications and som e properties o f chitinase from the live r o f a praw n(P enaeus jap onicus ) [ J]. Agric B io l Chem, 1990, 54( 8): 2 145~ 2 147.[ 4]  Tsou C L. K inetics of substrate reaction dur ing irreversiblem odification o f enzym e activ ity [ J]. Adv Enzym o lRe lated Areas Mo lB io,l 1988, 61: 381~ 436.[ 5]  Chen Q X, Song K K, W ang Q, et al. Inh ib itory effec ts o fm ushroom tyrosinase by som e a lkylbenza ldehydes[ J] . J Enzy Inh ib M ed Chem, 2003, 18( 6): 491~ 496.[ 6]  Chen Q X, L iu X D, H uangH. Inactiva tion kine tics o fmushroom tyrosinase in the d im ethy l su lfox ide solution[ J]. B iochem ( Moscow ), 2003, 68 ( 6): 644~ 649.[ 7]  Chen Q X, Zhang Z, Huang H, et al. Unfo lding and inactiva tion o f am pullarium crosseam B-g lucosidasedur ing dena turation by guan id ine hydrochlor ide[ J] . Int J B ioche Ce ll B io,l 2003, 35: 1 227~ 1 233.[ 8]  陈秀仁, 张怀有, 田锡义. 二甲亚砜的性质及应用 [ J] .辽宁化工, 2000, 29( 1): 31~ 35.[ 9]  Chen Q X, ZhangW, ZhengW Z, et al. Com pa rison of inactiva tion and un fo ld ing o f g reen crab a lkaline phos-pha tase dur ing denaturation by guan id inium ch lo ride[ J]. J Pro te in Chem, 1996, 15( 4) : 359~ 365.[ 10]  X ie X L, Chen Q X. Inac tivation k inetics ofB-N-acety-lD-g lucosam inidase from prawn (P enaeus vannam ei)in the dioxane so lution [ J]. B iochem istry (Moscow), 2004, 69( 12): 1 365~ 1 371.Inactivation k inetics of N-acety-lB-D-glucosam inidasefrom S cy lla se rra ta by dmi ethy lsulfoxideZHANG J-i p ing1, 2, CHEN Q ing-x i1( 1. Key Labo ra to ry o fM in istry of Educa tion for Ce ll B io logy and Tumo r Ce ll Eng ineer ing Schoo lo f L ife Sc iences, X iam en University, X iam en 361005, Ch ina; 2. Schoo l of L ife Sciences, F oshanSc ience and Techno logy Co lleg e, Foshan 528231, China)Abstrac:t The effect of d imethy lsu lfox ide ( DMSO ) on N-acety-l B-D-glucosam inidase ( NAGase )from g reen crab ( Scy lla serra ta ) has been investigated. The resu lts show thatDM SO can inact ivatethe enzyme act iv ity, and the inactivatorps concentration leading to 50% o f enzyme act iv ity lost( IC50 ) is est imated to be 0. 75mo l/dm3. The inactivation of enzyme by DM SO is a reversible reac-t ion w ith remaining enzym e activ ity. Inact ivation kinet ics of the enzyme in DM SO so lu tions is studied#23#台 湾 海 峡 25卷using the Tsoupsmethod of the substrate reaction, and them icroscop ic rate constants for the free en-zyme and the enzym e-substrate complex are determ ined and compared. The resu lts show that k+ 0 ismuch larger than kc+ 0, ind icating amarked pro tective effect o f the substrate on the inact ivation reac-t ion of this enzyme by DM SO. M o reover, the va lue of forw ard inact ivation rate constants o f the en-zyme ( k+ 0 and kc+ 0 ) increased w ith increasing DM SO concentration w h ile the value of reverse reac-t ion ( k- 0 ) decreased. The resu lts suggest that the inactivation o f enzyme in h igher concentration o fDM SO would be much d ifficu ltly reversib le.Key words: m ar ine organ ism; N-acety-l B-D-g lucosam in idase ( NAGase) ; experimental research;Scy lla serrata; dim ethy lsulfox ide; inact ivat ion k inetics(责任编辑:郭水伙 )#24#

锯缘青蟹NAGase在DMSO溶液中的失活动力学

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/19824/%e9%94%af%e7%bc%98%e9%9d%92%e8%9f%b9NAGase%e5%9c%a8DMSO%e6%ba%b6%e6%b6%b2%e4%b8%ad%e7%9a%84%e5%a4%b1%e6%b4%bb%e5%8a%a8%e5%8a%9b%e5%ad%a6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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