目的:探讨MDR1基因位点单核苷酸多态性与肝癌易感性的关系。方法:采用病例对照研究,应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因型分析技术测定原发性肝癌组及正常健康对照组各100例MDR1基因G2677T/A位点。以χ2检验比较MDR1多态基因型及相关危险在病例与对照之间分布的差异,采用非条件Logistic回归分析多态基因型与肝癌发生危险度的关系。结果:肝癌组MDR1基因2677A携带型低于健康对照组(P<0.05);经Logistic回归分析发现2677A携带型的个体患肝癌的危险显著降低,2677A携带型暴露于危险因素下患肝癌风险降低。肝癌组MDR1基因2677T携带型高于健康对照组(P<0.05);经Logistic回归分析发现2677T携带型的个体患肝癌的危险增加,2677T携带型暴露于危险因素下患肝癌风险增高。结论:MDR1基因2677A多态性可能是防止肝癌形成的保护因素,2677T多态性可能是肝癌形成的易感因素

冯水土

张永兴

杨芳

陈毅德

Xiamen University Institutional Repository

MDR1基因多态性与肝癌易感性的关系1 361260 厦门大学医学院预防医学系361026 福建厦门 厦门市第二医院肿瘤科陈毅德, 杨 芳, 冯水土, 张永兴1摘 要 目的:探讨 MDR1基因位点单核苷酸多态性与肝癌易感性的关系。方法: 采用病例对照研究,应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性 ( PCR RFLP )基因型分析技术测定原发性肝癌组及正常健康对照组各 100例 MDR1基因 G2677T /A位点。以 2检验比较 MDR1多态基因型及相关危险在病例与对照之间分布的差异,采用非条件 Log istic回归分析多态基因型与肝癌发生危险度的关系。结果:肝癌组 MDR1基因 2677A携带型低于健康对照组 (P < 0 05);经 Log istic回归分析发现 2677A携带型的个体患肝癌的危险显著降低, 2677A携带型暴露于危险因素下患肝癌风险降低。肝癌组 MDR1基因 2677T携带型高于健康对照组 (P < 0 05);经 Log istic回归分析发现 2677T携带型的个体患肝癌的危险增加, 2677T携带型暴露于危险因素下患肝癌风险增高。结论: MDR1基因 2677A多态性可能是防止肝癌形成的保护因素, 2677T多态性可能是肝癌形成的易感因素。关键词 肝细胞癌; MDR1; 基因多态性; 遗传易感性中图分类号: R735 7 文献标识码: A 文章编号: 1009- 0460( 2009) 12- 1077- 05A case control study on the association between genetic po lymorphism s of MDR1 and hepatic cellcancer susceptib ilityCHEN Yi d e, YANG Fang, FENG Shui tu, ZHANG Yong x ing. D epartm ent of M ed ical Oncology, the S econdH osp ital of X iam en, X iam en 361026, ChinaAbstract Objective: To study the asso ciation be tw een gene tic po lym orphism s o fMDR1 and hepa tic ce ll cancer susceptib ility. M ethods: The exper im enta l sub jec ts com posed o f 100 cases w ith pr im ary hepatocellu lar ca rc inom a and 100 healthy con tro ls. Thepo lymo rph ism gene tic type of G2677T /A o fMDR1 was analyzed by PCR RFLP. The d istribution d ifferences of po lym orph isms o fMDR1and re lated risk betw een the case g roup and control group w ere analyzed by ch i squa re test. The re lationship o f polym orph ism genotypew ith r isk o f hepatocellu lar carc inom aw as ana ly zed by log istic reg ression. Resu lts: It was observ ed by log istic reg ression ana ly sis thatthe risk of suffer ing hepatoce llular carc inom a reduced significantly in ind iv idua ls carrying a t least one alle le o f A, the risk of su ffer inghepatoce llular carcinoma increased sign ifican tly in indiv iduals carry ing at least one a llele of T. Conc lu sion: MDR1 gene po lym orphismo f 2677A m ay be a pro tective gene of hepatoce llu la r carc inom a, 2677T m ay be a r isk gene for hepa toce llular carcinom a.KeyW ords H epatocellu lar carc inom a; MDR1; Genetic po lymo rph ism; H ereditary susceptibility肝细胞癌 ( hepatoce llular carc inom a, HCC )是对人类健康和生命威胁较大的恶性肿瘤之一。尽管已知 HCC与乙型或丙型肝炎病毒感染、肝硬化、黄曲霉素、生活方式及环境等因素有关,但仅有小部分暴露于这些危险因素的人群发生肝癌, 究其原因可能与人群或个体的肿瘤易感性有关。人类多药耐药基因 (M uh idrugresistancegene1, MDR1)位于第 7号染色体长臂上,含有 28个外显子,内含子与外显子交界符合经典的 A /G规则, 全长为 4 5kb,含有一个开放读框,编码 1 280个氨基酸多肽,经糖基化后形成170KD的膜糖蛋白 ( P g lucoprote in, P gp) , 其生理作用是保护细胞免受毒物及代谢产物损害。近年来的研究发现, MDR1多态性不仅是影响肿瘤患者对化疗药物反应的重要遗传因素, 也与患者对疾病的易感性及临床表现有关。本研究采用病例对照研究方法, 应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性( PCR RFLP)基因型分析技术对原发性肝癌组及正常健康对照组 MDR1基因 G2677T /A位点进行测定, 旨在探讨 MDR1基因位点单核苷酸多态性与肝癌遗传易感性的相关性, 为肝癌高危人群的确立提!1077!临床肿瘤学杂志 2009年 12月第 14卷第 12期 Ch inese C lin ica lOncology, Dec. 2009, Vo .l 14, No. 12供依据。1 资料与方法1 1 标本来源 福建地区 100例原发性肝癌病例和 100例正常健康对照者外周静脉血。病例为2007年 1月 ~ 2008年 2月在我市三乙以上医院诊断的原发性肝癌患者,诊断符合 2001年 9月第八届全国肝癌学术会议通过的原发性肝癌的诊断标准。所有患者抽血前均未进行过化疗及放疗。正常对照选自我院健康体检的人群, 体检结果报告为无肿瘤及遗传性疾病。正常对照按性别及年龄 ( ∀ 5岁 )与病例频数匹配。收集每个研究对象详细的人口学资料以及相关危险因素暴露资料,并填写统一制定的调查表格。抽取肝癌患者及健康体检者外周静脉血2m l于加有 EDTA的抗凝试管内,迅速放入液氮罐中,再转入 - 90# 低温冰箱保存备用。1 2 主要试剂 全血 DNA提取试剂盒, 琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒 ( Q iagen公司,德国 ); M DR1引物 ( Sangon, 上海 )。1 3 方法1 3 1 DNA提取 取 1 5m l EP管, 用 200 l PBS液洗涤、重悬全血分离出的单个核细胞, 加入 20%蛋白酶 K20 ,l再加入 200 l Buffer, 振荡混匀 15s。将含有混合液的 EP管置于 56# 水浴 10m in。取出EP管,冷却至室温, 加入 200 l无水乙醇, 充分振荡15s。将混合液转移至试剂盒中提供的过滤柱内,14 000r /m in离心 1m in, 弃去滤过的液体。小心打开过滤柱盖子,加入 500 l Buffer, 将过滤柱放入另一新的空离心管, 8 000r /m in离心 l m in,弃去滤过的液体。小心打开过滤柱盖子, 加入 500 l Buffer,将过滤柱放入另一新的空离心管, 14 000r /m in离心3m in,弃去滤过的液体。重复离心 1m in, 使 Buffer液充分离去。小心打开过滤柱盖子, 视细胞的量加入 100~ 200 l Buffer, 将过滤柱放入一干净 1 5m lEP管,室温静置 1m in, 充分溶解 DNA, 8 000 r /m in离心 1m in, - 20# 保存液体备用。1 3 2 PCR扩增反应 引物 G2677A,上游: AGAGCATAGTAAGCAGTAGGGAGTA, 下游: GCAAATCTTGGGACAGGAATA; G2677T 上游: AGTAAGCAGTAGGGAGTAACA,下游: GATAAGAAAGAACTAGAACGT。 PCR扩增反应条件: 94# 4m in, 94#45s, 54# 45s, 72# 45s,共 34个循环, 72# 45s, 4#保存。1 3 3 PCR产物纯化 按试剂盒说明书操作。1 3 4 RFLP法检测 MDR1基因型 取干净 EP管, 依次加入下述液体, 使总体积为 20 ,l具体如下: dd H 2O 11 ,l 10 ∃ buffer 2 ,l限制性内切酶( G2677A: R sa % , G2677T: A cl% ) 1 ,l PCR回收产物 6 l。37# 水浴孵育 3h, 65# 酶灭活 5m in中止反应。将酶切产物 5 l点样于 1 5%琼脂糖凝胶, 加入 1 l LoadingBu ffer混匀上样, 银染后在凝胶扫描成像系统中拍照。1 4 统计学分析 以2检验比较各基因型及相关危险因素暴露在病例与对照之间分布的差异。采用非条件 Log istic回归分析多态基因型与肝癌的相关关系及其与危险因素的交互作用。采用统计软件SPSS 12 0作相关分析。2 结 果2 1 研究对象的基本特征 本研究病例组和对照组共 200例,其中对照组 100例,病例组 100例。所有研究对象均来自福建地区, 年龄范围 30~ 81岁,病例组平均年龄 ( 55 8 ∀ 14 7)岁, 对照组 ( 54 5 ∀13 9)岁,两组间差异无显著性。病例组男性 91例、女性 9例,对照组男性 90例、女性 10例,两组间差异无显著性。2 2 PCR及酶切结果 MDR1 G2677A和 G2677T基因型依据片段长度判断, G2677A 扩增产物为256bp,经 R sa %酶切后, A基因产生 101bp、82bp、73bp 3个片段, T或 G基因产生 183bp和 73bp 2个片段; G2677T扩增产物为 114bp, 经 A cl %酶切后,T基因产生 94bp片段, A 或 G基因仍经扩增为114bp。见图 1、图 2。图 1 MDR1基因多态性 G2677A的银染后基因型判定2 3 肝癌组和对照组 MDR1基因型分布情况 肝癌组和正常对照组基因型分布均符合 HardyW ein!1078! 临床肿瘤学杂志 2009年 12月第 14卷第 12期 Ch inese C lin ica lOncology, Dec. 2009, Vo .l 14, No. 12图 2 MDR1基因多态性 G2677T的银染后基因型判定berg平衡。肝癌组 A等位基因频率 21% ,而对照组为 30%; 肝癌组 T等位基因频率 33% ,而对照组为24 5%; 对照组和肝癌组 A携带型与 A非携带型比例有显著差异 (P < 0 05) , T携带型与 T非携带型亦有显著差异 (P < 0 05)。见表 1、表 2。表 1 两组基因型分布比较项目 肝癌组 ( n= 100) 对照组 ( n= 100)AA 6 9AT 14 16GA 16 26TT 6 3GT 40 27GG 18 19A携带 36 51*A非携带 64 49*T携带 60 46*T非携带 40 54*注: * P < 0 05表 2 两组 MDR1等位基因比较 [例 (% ) ]等位基因 肝癌组 对照组A 42( 21 0) 60( 30 0)T 66( 33 0) 49( 24 5)合计 108( 54 0) 109( 54 5)2 4 MDR1基因多态性与肝癌易感性的关系 AA纯合体患肝癌的危险显著低于 A杂合体; TT纯合体患肝癌的危险显著高于 T杂合体。以携带 A基因型的人群为参照组,携带至少 1个 A等位基因的个体患肝癌的危险显著降低, A等位基因携带者患肝癌的危险性是 A等位基因非携带者的 0 54倍 ( OR= 0 54, 95% CI: 0 31~ 0. 95)。携带至少 1个 T等位基因的个体患肝癌的危险增加, T等位基因携带者患肝癌的危险性是 T等位基因非携带者的 1 76倍 ( OR= 1 76, 95% C I: 1 51~ 2 05)。基因型与肝癌易感性相关,与年龄、性别无关。见表 3、表 4。表 3 MDR1多态基因型与肝癌患病危险度项目肝癌组( n= 100)对照组( n= 100)OR ( 95% CI) PAA 6 9AT /GA 30 420 41( 0 103~ 1 632) 0 027TT 6 3AT /GT 54 433 58( 0 951~ 13 599) 0 033表 4 MDR1多态基因型与肝癌患病危险度项目 A携带 A非携带 T携带 T非携带分组肝癌组 36 64* 60 40&对照组 51 49 46 54性别男 33 58 54 37女 3 6 6 3年龄 (岁 )∋ 60 7 11 12 6< 60 29 53 48 34注: * OR= 0 54( 95% C I: 0 307~ 0 949) , P = 0 038; & OR = 1 076( 95% C I: 1 51~ 2 05 ) , P = 0 0412 5 MDR1基因多态性对肝癌发生的预测 将HBV +、HCV +和肝硬化纳入 MDR1基因多态性对肝癌发生和预测分析模型中, 已明确 HBV +、HCV +和肝硬化均为肝癌发生的危险因素, 经分别校正上述危险因素干扰后,结果显示, 携带至少 1个 A等位基因患肝癌的危险明显降低,携带至少 1个 T等位基因患肝癌的危险明显增加 (P< 0 05)。见表 5。3 讨 论国家卫生部 2004年颁发的(中国癌症预防与控制规划纲要 ( 2004~ 2010) )指出: 肝癌、食管癌、胃癌、宫颈癌和鼻咽癌等传统高发癌症,与发病率正在!1079!临床肿瘤学杂志 2009年 12月第 14卷第 12期 Ch inese C lin ica lOncology, Dec. 2009, Vo .l 14, No. 12表 5 MDR1基因多态性与危险因素对肝癌发生的影响因素2677A携带 2677A非携带肝癌组 对照组 肝癌组 对照组P2677T携带 2677T非携带肝癌组 对照组 肝癌组 对照组PHBV+ 24 4 58 3 0 029 49 2 33 5 0 045HCV+ 5 0 9 1 0 031 10 1 4 0 0 037肝硬化 18 0 32 3 0 022 32 2 18 1 0 047迅速上升的结直肠癌、肺癌及乳腺癌等并列为我国目前重点防治的八大恶性肿瘤, 这 8种恶性肿瘤死亡约占总死亡人数的 80%以上[ 1]。其中肝癌是发病率和 5年病死率均较高的肿瘤。但是, 由于与其它肿瘤相比肝癌具有发现晚、手术切除率低和生存期短等特点, 对肝癌的基础研究较其它肿瘤相对较少。原发性肝癌是指原发于肝实质细胞或肝内胆管上皮细胞的癌肿。由于绝大多数肝癌 ( 85% ~ 90%以上 )是来源于肝细胞, 所以通常所说的原发性肝癌多指肝细胞癌 (HCC,以下简称肝癌 )。因为肝癌早期症状隐匿, 所以发现时多为晚期。而晚期病情进展迅速,因此生存时间很短, 5年生存率极低, 仅约为 3% ~ 5%。肝癌在世界范围内流行广泛, 每年约有 62万人被诊断为肝癌,发病率居所有恶性肿瘤的第 6位。每年因肝癌死亡的人数约 60万,居所有癌症死因的第 3位,仅次于肺癌和胃癌。肝癌的发病情况在我国更为严峻,全世界新发的肝癌病例中,高达 55%发生在中国[ 2],也就是说,每年约有 30多万人被诊断为肝癌。我国原发性肝癌每年的年龄调整死亡率约为 23 /10万人,即每年超过 35万人死于肝癌。由此看来,肝癌的病因学研究在我国显得尤为重要。以往对肝癌的病因学研究结果表明, 肝癌的发生可能与多种因素有关,包括乙型和丙型肝炎病毒感染、肝硬化、黄曲霉素及吸烟酗酒环境因素等[ 3]。但是为什么同样处于上述危险因素之中的不同个体,却有发生与不发生肝癌的差异呢? 这些现象提示我们,肝癌的发病可能与个体对危险因素的敏感性有关。MDR1位于第 7号染色体, 编码相对分子质量为 170 000的 P gp。一般认为 P gp由相同的两亚基组成, 每部分含 6个跨膜区域和 1个细胞内的 ATP连接区,两亚基由一多肽连接物分开,两部分可相互作用形成一跨膜转运体。P gp作用类似一个泵,由ATP提供能量,可将细胞内药物泵出细胞外,其生理作用是保护细胞免受毒物及代谢产物损害; 在肿瘤细胞,则造成对多种结构及作用机制不同抗癌药的耐受。关于多药耐药基因多态性的最初报道发表于1989年, 但系统的对 MDR1多态性的筛选由 Ho ffmeyer等于 2000年完成, 他们在 188例高加索人中,共筛选出 15种单核苷酸多态性 ( sing le nucleotidepo lymorphism, SNP)。此后, 国外有不少关于 MDR1基因多态性与肿瘤临床关系研究陆续报道。近年的研究发现, MDR1基因的多态性不仅与患者对药物的耐受及化疗药物的代谢转化等有关,也与患者对疾病的易感性及临床表现有关。目前在 MDR1基因至少鉴定出 28个单核苷酸多态性, 其中 7个位于内含子上, 有 11个造成氨基酸改变,其余为静止突变。MDR1 C3435T基因多态性与白血病、结直肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、胃癌等恶性肿瘤易感性的相关性研究已有报道[ 4 11],在肝癌方面的研究国内外尚少见报告。而关于 MDR1 2677位点的基因多态性研究则更少,且大多为阴性结果[ 12]。应当认识到, MDR1 2677A在人群中的突变率很低,尤其在白人中更低,这可能导致与目前关于 2677A研究的报道较少有关。本研究中,我们首次发现, MDR1 2677基因型中至少携带一个 A等位基因的个体催患肝癌的危险显著降低,携带至少 1个 T基因的个体患肝癌的危险增加, 结果有统计学差异, 在暴露于危险因素下时, 亦得到类似结果。提示 MDR1 2677A等位基因可能是肝癌的保护因素, T等位基因可能是肝癌的易感因素。这将在肝癌的早期诊断中具有重要意义。本实验中的研究对象只局限于我国福建地区,故 MDR1 2677A及 T携带型在其他人种 (高加索人、非洲黑人等 )中的应用价值有待进一步研究。参考文献[ 1 ] 卫生部.中国癌症预防与控制规划纲要 ( 2004 2010) [ J] .中!1080! 临床肿瘤学杂志 2009年 12月第 14卷第 12期 Ch inese C lin ica lOncology, Dec. 2009, Vo .l 14, No. 12国肿瘤, 2004, 13: 65- 68.[ 2 ] Park inDM, Fredd ie B, Ferlay J, et a.l G lob al can cer stat ist ics,2002[ J] . 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MDR1基因多态性与肝癌易感性的关系

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/18267/MDR1%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e5%a4%9a%e6%80%81%e6%80%a7%e4%b8%8e%e8%82%9d%e7%99%8c%e6%98%93%e6%84%9f%e6%80%a7%e7%9a%84%e5%85%b3%e7%b3%bb.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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