灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)发酵液通过硫酸铵盐析、Sephadex G-100分子筛、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析,分离纯化一种外切葡聚糖酶(CBH)和一种内切葡聚糖酶(EG).通过SDS-PAGE和凝胶柱层析法测定分子质量表明:CBH全酶分子质量为71 ku,由两个分子质量为35 ku的同型亚基组成;EG为单体蛋白,全酶分子质量为32 ku.酶学性质研究表明:CBH催化pNPC的最适pH为6.0,最适温度为55℃,酶活在pH 5.0~8.0区间和温度低于55℃时稳定;EG催化CMC-Na的最适pH为4.0,最适温度为50℃,酶活在pH3.5~7.5区间和温度低于65℃时稳定.Na+、K+、Ba2+、Mg2+以及NO3-和SO42-对CBH和EG酶活均无影响;Ca2+和Mn2+对CBH有激活作用,Fe2+和Mn2+对EG有激活作用,而Zn2+、Cd2+和Cu2+对CBH和EG均有不同程度的抑制效应.酶动力学分析表明:CBH催化pNPC水解的米氏常数Km值为1.4 mmol/L(pH 6.0,55℃),EG催化CMC-Na水解的米氏常数Km值为5.0 mg/mL(pH 4.0,50℃)

邬小兵

陈清西

陶毅明

马素娟

黄建忠

龙敏南

Xiamen University Institutional Repository

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net第 49 卷 　第 3 期 厦门大学学报 (自然科学版) Vol. 49 　No. 3　2010 年 5 月 Journal of Xiamen University (Nat ural Science) May 2010 　灰 绿 曲 霉 产 纤 维 素 酶 的 研 究陶毅明1 ,马素娟1 ,邬小兵1 ,龙敏南1 , 2 ,黄建忠3 ,陈清西1 ,3 3(1. 厦门大学 生命科学学院 ,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 ;2. 厦门大学能源研究院 ,福建 厦门 361005 ;3. 福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心 ,福建 福州 351008)　　收稿日期 :2009209204基金项目 :国家重点基础研究计划 (2010CB732201) ;福建省自然科学基金 (2009J01196) ;福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心开放课题 ( IM 200802)3 通讯作者 :chenqx @xmu. edu. cn摘要 :灰绿曲霉 ( A s pergi l l us glaucus) 发酵液通过硫酸铵盐析、Sephadex G2100 分子筛、DEA E Sepharose Fast Flow 离子交换柱和 Phenyl Sepharose Fast Flow 疏水层析 ,分离纯化一种外切葡聚糖酶 (CB H)和一种内切葡聚糖酶 ( EG) . 通过SDS2PA GE 和凝胶柱层析法测定分子质量表明 : CB H 全酶分子质量为 71 ku ,由两个分子质量为 35 ku 的同型亚基组成 ; EG为单体蛋白 ,全酶分子质量为 32 ku. 酶学性质研究表明 :CB H 催化 pN PC 的最适 p H 为 6. 0 ,最适温度为 55 ℃,酶活在 p H 5. 0～8. 0 区间和温度低于 55 ℃时稳定 ; EG催化 CMC2Na 的最适 p H 为 4. 0 ,最适温度为 50 ℃,酶活在 p H3. 5～7. 5 区间和温度低于 65 ℃时稳定. Na + 、K+ 、Ba2 + 、Mg2 + 以及 NO -3 和 SO2 -4 对 CB H 和 EG酶活均无影响 ;Ca2 + 和Mn2 + 对 CB H 有激活作用 ,Fe2 + 和 Mn2 + 对 EG有激活作用 ,而 Zn2 + 、Cd2 + 和 Cu2 + 对 CB H 和 EG均有不同程度的抑制效应.酶动力学分析表明 :CB H 催化 pNPC 水解的米氏常数 Km 值为 1. 4 mmol/ L (p H 6. 0 ,55 ℃) ,EG催化 CMC2Na 水解的米氏常数 Km 值为 5. 0 mg/ mL (p H 4. 0 ,50 ℃) .关键词 :灰绿曲霉 ;纤维素酶 ;外切葡聚糖酶 ;内切葡聚糖酶 ;分离纯化 ;酶学性质中图分类号 :Q 556. 2 　　　　文献标识码 :A 　　　　　文章编号 :043820479 (2010) 0320391205　　纤维素是自然界中分布最广、含量最为丰富的一类多糖. 植物体中碳素的一半以上存在于纤维素中. 天然纤维素是β2D2葡萄糖分子以β21 ,42糖苷键结合形成的线形长链分子 , 约 3 000～10 000 个葡萄糖残基构成. 能够水解天然纤维素的纤维素酶是一个复杂的多酶体系 ,一般认为纤维素酶有 3 种主要组分[1 ] , 即外切葡聚糖酶 ( CB H , EC 3. 2. 1. 91) 、内切葡聚糖酶( EG , EC 3. 2. 1. 4)和β2葡萄糖苷酶 (B G , EC 3. 2. 1.21) . 由于纤维素酶能将环境中的废纸、木屑和其它纤维废料转化为葡萄糖 ,从而发酵为酒精 ,因而自从 20世纪初纤维素酶被发现以来 ,它的研究和应用就受到了国内外学者的极大关注.目前已从细菌、真菌、软体动物和牛的瘤胃等[224 ]分离得到了不同来源的纤维素酶. 本文从自行筛选的灰绿曲霉的发酵液中[5 ] ,分离纯化出 CB H 和 EG ,并对其基本酶学性质进行了研究.1 　材料与方法1. 1 　菌 　株灰绿曲霉 ( A s pergi l l us gl aucus) 由实验室自行筛选得到的能够降解纤维素的曲霉菌株[5 ] .1. 2 　主要试剂Sep hadex G2100、D EA E Sep harose Fast Flow、Phenyl Sep harose Fast Flow 为 Pharmacia 公司产品 ;对硝基酚纤维二糖苷 ( pN PC) 为 Sigma 产品 ;其余试剂均为国产分析纯.1. 3 　实验方法发酵培养基 :每升液体培养基中含 ( N H4 ) 2 SO41. 4 g ,尿素 0. 3 g , KH2 PO4 2. 0 g , CaCl2 0. 3 g , Mg2SO4 ·7 H2 O 0. 3 g , 蛋白胨 0. 5 g , FeSO4 ·7 H2 O 5mg , ZnSO4 ·7 H2 O 1. 4 mg , MgSO4 ·H2 O 1. 6 mg ,CoCl2 2. 0 mg , 30 g 稻草粉 ,1 mL 吐温 80 .粗酶液的预处理 :扩大培养 2 d 的菌株按 1 %接种量接种到 1 L 液体产酶培养基中 ,于摇床震荡培养 7 d(200 r/ min ,30 ℃) . 粗酶液经过 4 000 r/ min 4 ℃离心30 min 去除菌体和残渣后 ,在上清液中缓慢加入(N H4 ) 2 SO4 至 90 %饱和度 ,4 ℃静置过夜. 4 000 r/min 4 ℃离心 30 min ,收集沉淀 ,溶于 0. 02 mol/ L p H© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net5. 0 HAc2NaAc 缓冲液中. 透析袋脱盐 ,用 BaCl2 检测直到无 SO2 -4 ,用聚乙二醇 20 000 浓缩 ,得到上样前的粗酶液.分子筛层析 :葡聚糖凝胶 Sep hadex G2100 装柱 ,柱规格为 25 cm ×80 cm ,用 0. 02 mol/ L p H 5. 0HAc2NaAc (含 0. 1 mol/ L NaCl) 缓冲液进行洗脱 ,上样量为 2 mL ,流速为 1 mL/ min ,每 6 min 收集 1 管.离子交换柱层析 :D EA E Sep harose Fast Flow 装柱 ,柱规格为 25 cm ×40 cm ,洗脱时先用不含 NaCl 的0. 1 mol/ L p H 7. 8 Tris2HCl 缓冲液淋洗除去杂蛋白 ,然后用含 0～0. 3 mol/ L NaCl 的相同缓冲液进行梯度洗脱 ,上样量为 2 mL ,流速为 1 mL/ min ,每 6 min 收集 1 管.疏水层析 : Phenyl Sep harose Fast Flow 装柱 ,柱规格为 1. 5 cm ×13 cm ,洗脱时先用含 0. 4 mol/ LNaCl 的 0. 1 mol/ L p H 7. 8 Tris2HCl 缓冲液淋洗 ,当A 280不变时 ,换不含 NaCl 的相同缓冲液进行梯度洗脱 ,上样量为 1 mL ,流速为 0. 5 mL/ min ,每 10 min 收集 1 管.SDS2PA GE 电泳 :分离胶浓度为 0. 12 g/ mL ,浓缩胶浓度为 0. 05 g/ mL ,4 ℃220 V 稳压电泳. 考马斯亮蓝法染色.Sep hadex G2100 凝胶柱层析法测定分子质量 :在相同条件下 ,蛋白的洗脱体积 V 和分子质量的对数 lg( MW )近似成线性关系. 选用牛血清蛋白 (BSA ,68. 5ku) 、鸡卵清蛋白 ( albumin egg , 46 ku) 、胰蛋白酶(t ryp sin ,25. 2 ku)和胰岛素 (insulin ,12. 8 ku) 做标准蛋白.EG活力测定[ 6 ] :50μL 酶液加入 50μL 0. 2 mol/L p H 4. 0 HAc2NaAc 缓冲液和 200 μL 10 mg/ mLCMC2Na (羧甲基纤维素钠) 底物 , 50 ℃水浴 30 min后 ,加入 700μL 水 ,再加入 2 mL DNS 显色液终止反应.沸水浴 10 min 后 ,在酶标仪上测 A 540吸光值. 通过标准曲线查得葡萄糖含量. 每分钟水解产生 1μmol 葡萄糖为一个酶活单位 (U) .CB H 活力测定[6 ] : 50 μL 酶液加入 50 μL 0. 2mol/ L p H 6. 0 HAc2NaAc 缓冲液和 200μL 2 mmol/L pN PC 底物 ,55 ℃水浴 30 min 后 ,加入 700μL 20mg/ mL Na2 CO3 终止反应. 在酶标仪上测 A 410 吸光值. 通过标准曲线查得 pN P 含量. 每分钟水解产生 1μmol pN P 为一个酶活单位 (U) .糖含量测定按 DNS 法[7 ] .2 　实验结果2. 1 　CBH与 EG的分离纯化灰绿曲霉发酵液用 0. 9 g/ mL 硫酸铵沉淀 ,经葡聚糖凝胶 Sep hadex G2100 分子筛层析后得到 2 个蛋白峰 (峰 I 和峰 II) ,峰 I 有 CB H 活性 ,峰 II 有 EG 活性. 峰 I 经 Phenyl Sep harose Fast Flow 苯基疏水层析 ,去杂蛋白 ,得到 CB H ;峰 II 经 DEA E2Sep haroseFast Flow 阴离子交换层析 ,去杂蛋白 ,得到 EG. 纯化的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳均得到单一条带 ,表明已达到电泳单一纯.2. 2 　酶的基本性质2. 2. 1 　酶分子质量的测定经 SDS2PA GE (图 1) 和 Sep hadex G2100 凝胶过滤柱层析法 (图 2) 测定 ,CB H 是二聚体酶 ,由 2 个分子质量为 35 ku 的同型亚基组成 ,全酶分子质量约为71 ku. EG为单体蛋白 ,全酶分子质量约为 32 ku.　图 1 　灰绿曲霉 CB H (a)和 EG(b)的 SDS2PA GE 图谱　Fig. 1 　SDS2PA GE of CB H (a) and EG (b) f rom A . glaucus　图 2 　凝胶过柱层析法测定 CB H 和 EG全酶分子质量　Fig. 2 　Determination of molecular weight of CB H and EGby gel filt ration·293· 厦门大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2010 年© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net　　图 3 　CB H (a)和 EG(b)底物催化动力学常数的测定　　Fig. 3 　Determination of catalytic kinetics constant s of CB H (a) and EG (b)2. 2. 2 　酶催化反应的动力学特征测定不同浓度的 pN PC 或 CMC2Na 为底物时对酶反应的影响 ,Lineweaver2Burk 双倒数法求得酶动力学常数 Km (图 3) . 结果表明 ,CB H 和 EG催化反应初速度与底物浓度都成典型双曲线关系 ,说明它们催化 pN PC 和 CMC2Na 水解的反应遵循米氏方程. 在p H 6. 0 ,55 ℃下 , CB H 催化 pN PC 的 Km 值为 1. 4mmol/ L ;在 p H 4. 0 , 50 ℃下 , EG 催化 CMC2Na 的Km 值为 5. 0 mg/ mL .2. 2. 3 　pH对酶活力及稳定性的影响参考文献[ 7 ] ,改变缓冲液的 p H 值 ,测定 p H 对CB H 和 EG酶活力的影响 ,结果见图 4. 酶活力对反应的 p H 作图 ,得到一个钟罩形曲线 ,求得 CB H 催化反应的最适 p H 值为 6. 0 ,EG为 4. 0. 将酶液与不同 p H值的缓冲液置于 4 ℃下处理 2 h ,然后取出 50μL 处理的酶液 ,在各自的测活体系 ( CB H 为 p H 6. 0 ,55 ℃;EG为 p H 4. 0 ,50 ℃)检测酶的剩余活力 ,以酶活力对p H 作图 ,结果见图 5. 表明 CB H 在 p H 5. 0～8. 0 区间较稳定 ,EG在 p H 3. 5～7. 5 区间较稳定.　图 4 　p H 对 CB H 和 EG活力的影响　Fig. 4 　Effect of p H on CB H and EG activities　图 5 　CB H 和 EG的 p H 稳定性　Fig. 5 　p H stability of CB H and EG2. 2. 4 　温度对酶活力及稳定性的影响参考文献[ 8 ] ,改变测活条件的反应温度 ,研究温度对酶活力的效应 ,结果见图 6 ,酶活力与反应温度作图为一个钟罩形曲线 , CB H 催化反应的最适温度为55 ℃,EG为 50 ℃. 取一定量的酶液在不同温度下保温 30 min ,然后迅速冷却到室温 ,取出 50μL 热处理的酶液在各自的测活体系 (CB H 为 p H 6. 0 ,55 ℃; EG为 p H 4. 0 ,50 ℃) 检测酶的剩余活力 ,以酶活力对温度作图 (图 7) . 实验表明 CB H 在 65 ℃以下热变性 30min ,酶活力基本上保持不变 ; EG在 55 ℃以下热变性30 min ,酶活力基本上保持不变. 可见 CB H 和 EG 都具有较好的热稳定性 ,有助于工业上的应用.2. 2. 5 　金属离子对酶活力的影响在各自的测活体系中 ,加入不同浓度的金属离子 ,观察各种金属离子对酶活力的影响. 结果表明 (表 1) ,金属阳离子 Na + 、K+ 、Ba2 + 、Mg2 + 以及阴离子 NO -3和 SO2 -4 对 CB H 和 EG 酶活力都没有影响 ; Ca2 + 和Mn2 + 对 CB H 有激活作用 ,Fe2 + 和 Mn2 + 对 EG有激活·393·第 3 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　陶毅明等 :灰绿曲霉产纤维素酶的研究© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net　图 6 　温度对 CB H 和 EG活力的影响　Fig. 6 　Effect of temperature on CB H and EG activities　图 7 　CB H 和 EG的温度稳定性　Fig. 7 　Temperature stability of CB H and EG作用 ,而 Zn2 + 、Cd2 + 和 Cu2 + 对 CB H 和 EG 均有不同程度的抑制效应.3 　讨　论真菌是纤维素酶的重要来源 ,产纤维素酶的真菌主要集中在木霉属、青霉属和曲霉属. 产纤维素酶的曲霉主要为黑曲霉、米曲霉、根曲霉等[9 ] . 灰绿曲霉是自行筛选的一株产纤维素酶的丝状真菌 ,目前还没有有关灰绿曲霉产纤维素酶方面的报道. 该菌株能有效地分解稻草、甘蔗渣等农业废弃物[5 ] . 纤维素酶是一个庞大的家族 ,真菌分泌的纤维素酶通常含有多种 CB H和 EG ,将它们一一分离纯化是很困难的. 本研究通过多种分离纯化手段 ,从其发酵液分离得到了一种 CB H和一种 EG ,两种酶在偏酸和中温条件下酶活最大 ,在p H 4. 0～7. 5 , 60 ℃以内酶活稳定 ,分子质量小于 100ku ,这与已经用于工业生产的瑞氏木霉相似[10 ] ,所以灰绿曲霉具有一定的工业应用潜力. 下一步我们将克隆该菌株的纤维素酶系基因 ,并对其进行分子改造 ,以提高酶的表达量、提高酶的耐碱和高温能力.表 1 　金属离子对 CB H 和 EG活力的影响Tab. 1 　Effect s of metal ions on the CB H and EG activities化合物浓度/(mmol·L - 1)CB H 相对活力/ %EG相对活力/ %对照 　　0 　100. 0 ±1. 7 　100. 0 ±1. 9NaCl 　　2 　98. 7 ±2. 1 　99. 4 ±2. 7NaNO3 　　2 　99. 2 ±1. 8 　98. 9 ±2. 5Na2 SO4 　　2 　98. 9 ±1. 9 　99. 1 ±2. 8KCl 　　2 　99. 1 ±2. 1 　98. 3 ±2. 4CaCl2 　　2 　118. 2 ±2. 6 3 3 　101. 2 ±2. 6MnCl2 　　2 　123. 7 ±2. 4 3 3 　120. 5 ±3. 2 3 3ZnCl2 　　2 　88. 4 ±2. 9 3 3 　91. 2 ±2. 7 3CdCl2 　　2 　76. 9 ±2. 8 3 3 　67. 6 ±3. 2 3 3BaCl2 　　2 　98. 8 ±2. 3 　99. 4 ±2. 9MgCl2 　　2 　99. 4 ±2. 8 　98. 6 ±3. 5CuCl2 　　2 　81. 3 ±3. 1 3 3 　84. 6 ±3. 2 3 3FeCl2 　　2 　101. 7 ±2. 9 　123. 3 ±3. 3 3 3　　所有数据以平均值 ±标准差给出 ( n = 3) . 3 与对照相比差异显著 ( p < 0. 05) , 3 3 差异极显著 ( p < 0. 01) .参考文献 :[1 ] 　Bhat M K. Cellulase and related enzymes in biotechnology[J ] . Biotechnology Advances ,2000 ,18 :3552383.[2 ] 　张 ,赵红 ,周兴旺 ,等.福寿螺β2葡萄糖苷酶的分离纯化及性质的初步研究 [J ] . 厦门大学学报 : 自然科学版 ,1999 ,38 (2) :2872291.[3 ] 　胥兵 ,陈惠 ,韩学易 ,等. 枯草芽孢杆菌 C236 纤维素酶的纯化及酶学性质 [J ] . 四川农业大学学报 ,2006 ,24 (4) :3982400.[4 ] 　赵广存 ,段承杰 ,庞浩 ,等. 牛瘤胃未培养细菌中一个β2葡萄糖苷酶基因 umbgl 3 A 的克隆和鉴定 [J ] . 西南农业学报 ,2005 ,18 (4) :4722476[5 ] 　徐昶 , 龙敏南 ,邬小兵 ,等. 高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究 [J ] . 厦门大学学报 :自然科学版 ,2005 ,44(1) :1072111.[6 ] 　Lee YJ , Kim B K ,Lee B H ,et al. Purification and charac2terization of cellulose produced by B aci l l us am yolique f a2ciens DL23 utilizing rice hull [J ] . Bioresource Technolo2gy ,2008 ,99 (2) :3782386.[7 ] 　Breuil C ,Saddler J N. Comparison of the 3 ,52dinit rosali2cylic acid and Nelson2Somogyi methods of assaying for re2ducing sugars and determining cellulase activity [J ] . En2zyme and Microbial Technology ,1985 ,7 (7) :3272332.[8 ] 　张继平 ,林建成 ,陈清西 ,等. 草鱼碱性磷酸酶的分离纯化·493· 厦门大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2010 年© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net与部分性质研究 [J ] . 厦门大学学报 :自然科学版 ,2005 ,44 (5) :6842687.[ 9 ] 　Zhang Y H P , Himmel M E ,Mielenz J R. Outlook for cel2lulase improvement : screening and selection st rategies[J ] . Biotechnology Advances ,2006 ,24 (5) :4522481.[10 ] 　汪天虹 ,吴静 ,邹玉霞. 瑞氏木霉分子生物学研究进展[J ] .菌物系统 ,2000 ,19 (1) :1472152.Cellulase Production from As per gillus gl aucusTAO Yi2ming1 ,MA Su2juan1 ,WU Xiao2bing1 ,L ON G Min2nan1 ,2 ,HUAN G Jian2zhong3 ,C H EN Qing2xi1 ,3 3(1. Key Laboratory of the Minist ry of Education for Cell Biology and Tumor Cell Engineering ,School of Life Sciences ,Xiamen University ; 2. School of Energy Research ,Xiamen University ,Xiamen 361005 ,China ; 3. Engineering ResearchCenter of Indust rial Microbiology ,Minist ry of Education ,Fujian Normal University ,Fuzhou 351008 ,China)Abstract :A cellobiohydrolase (CB H) and an endoglucanase ( EG) were purified f rom fermentation liquor of A s pergi l l us glaucus byfollowing procedures : ammonium sulfate precipitation , gel filt ration on Sephadex G2100 , ion2exchange chromatography on DEA ESepharos Fast Flow and hydrophobic chromatography on Phenyl Sepharose Fast Flow. By the methods of gel column chromatographyand SDS2PA GE ,the molecular weight of CB H was determined to be 71 ku ,consisted of two 35 ku subunit s ,and the EG was deter2mined to be a 32 ku monomer. Enzymatic properties showed that the optimum p H and temperature of CB H for the hydrolysis ofpN PC was at p H 6. 0 and 55 ℃, respectively ;CB H was stable at p H 5. 0～8. 0 and below 55 ℃; the optimum p H and temperatureof EG for the hydrolysis of CMC2Na was at p H 4. 0 and 50 ℃, respectively ; EG was stable at p H 3. 5～7. 5 and below 65 ℃. Na + ,K+ ,Ba2 + ,Mg2 + ,NO -3 and SO2 -4 had no effect s on CB H and EG activities. Ca2 + and Mn2 + activated CB H activity ,Fe2 + and Mn2 + ac2tivated EG activity ,while Zn2 + , Cd2 + and Cu2 + inhibited CB H and EG activities. Enzymatic kinetics indicated that Michaelis2Mentencontant ( Km) of the hydrolysis for pN PC by CB H was 1. 4 mmol/ L (p H 6. 0 , 55 ℃) and Km of the hydrolysis for CMC2Na by EGwas 5. 0 mg/ mL (p H 4. 0 , 50 ℃) .Key words :A s pergi l l us glaucus ;cellulase ;cellobiohydrolase ;endoglucanase ;purification ;enzymatic properties·593·第 3 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　陶毅明等 :灰绿曲霉产纤维素酶的研究

灰绿曲霉产纤维素酶的研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/19816/%e7%81%b0%e7%bb%bf%e6%9b%b2%e9%9c%89%e4%ba%a7%e7%ba%a4%e7%bb%b4%e7%b4%a0%e9%85%b6%e7%9a%84%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

灰绿曲霉产纤维素酶的研究

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