应用细胞膜片钳技术测定狗心室肌细胞的电生理特征、动作电位(AP)以及收缩的参数,并用统计学方法评价所测量的参数是否可将心内、外膜及中层(M)细胞有效地区分开。结果:获取52个混合的有3种心肌细胞的AP,以AP穹隆的高度以及AP切迹的膜电位水平和穹隆上升的速度将其分三组细胞。以穹隆的膜电位水平能有效区分心外膜与其他两种细胞(P0.05)。以AP时程(APD)可以有效区分M细胞与其他两种细胞(P0.05)。尖峰切迹时间以及收缩参数均不能有效区分三种心室肌细胞(P>0.05)。结论:狗心室单个细胞AP的一些参数,可以作为辨别心内、外膜,M细胞的依据

巩燕

王挹青

王焱

黄卫斌

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动作电位参数作为区分狗心室肌三种细胞的可行性研究王焱 巩燕 黄卫斌 王挹青摘要 应用细胞膜片钳技术测定狗心室肌细胞的电生理特征、动作电位 ( AP)以及收缩的参数, 并用统计学方法评价所测量的参数是否可将心内、外膜及中层 ( M )细胞有效地区分开。结果: 获取 52个混合的有 3种心肌细胞的AP, 以 AP穹隆的高度以及 AP切迹的膜电位水平和穹隆上升的速度将其分三组细胞。以穹隆的膜电位水平能有效区分心外膜与其他两种细胞 (P < 0. 05), 但不能有效区分心内膜和 M 细胞 (P > 0. 05)。以 AP时程 ( APD )可以有效区分 M细胞与其他两种细胞 ( P < 0. 05),但不能有效区分心内膜和心外膜细胞 (P > 0. 05)。尖峰 切迹时间以及收缩参数均不能有效区分三种心室肌细胞 (P > 0. 05)。结论: 狗心室单个细胞 AP的一些参数, 可以作为辨别心内、外膜, M 细胞的依据。关键词 电生理学 动作电位 心内膜细胞 心外膜细胞 心肌中层 M 细胞中图分类号 R331. 3+ 8 文献标识码 A 文章编号 1007- 2659( 2005) 06- 0472- 04WANG Y an, GONG Yan, HUANGW ei b in, e ta.l The Feasib ility ofD ifferen tiating Three Types ofA ction Potentials by Qua lifiedA ction Poten tia lParameters in Can ineV en tr icle. To de term ine whethe r som e pa rame ters in the actionpotentia ls( AP) can be used to separa te the three types o f can ine ven tricularmyocytes, theAP o f can ine ventr icularmyocy tew as stud ied by patch c lam p system in fifty two ventr icular myocytes. Statistica lly ana lyzed whethe r som e pa rapm eters o f APcan be used to d ifferentiate epiM and endocardia l m yocy tes. Resu lts: 52 ventricu la r m yocy tes w ere d iv ided into threeg roups o fm yocy tes by the amp litude o f the dom enotch level as we ll as in the upw ard slope of the dom e. Therew as a sign ificant difference be tw een Em levels of the dom e in epicard ia l type and M type asw e ll as between epicard ia l type and endoca rd ia l type( P < 0. 05), but therew as no sign ificant d ifference be tw een M and endoca rdia l type(P > 0. 05). Therew as a sign ifican t diffe rence in AP duration betw eenM type and ep icardia l type as w ell as endoca rdia l type(P < 0. 05), bu t no s ignificant d ifference between ep icardial and endoca rdia l type( P > 0. 05). And there was ne ithe r sign ificant difference in sp iketo no tch tim e nor in the con trac tion param eter am ong the three groups ( P > 0. 05 ). Conc lusion: Instead of ana tom ica lm ethods, certa in param ete rs in theAP can be used to d istinguish epicard ia ,l m id m yocard ia l ( M ) and endocard ia l myocy tes. [ Chinese Journal of Card iac Pacing and E lectrophy siology, 2005, 19( 6): 472~ 475]Electrophysiology Ac tion poten tial Ep icardial myocy te M idmyocy te Endocardia lmyocy tes作者单位:厦门大学医学院 厦门中山医院心脏中心 (福建厦门361004 )X iam en H eart C enter, X iam en Zhongshan H ospital of X iam enUn iversity, X iam en 361004, Ch ina作者简介:王焱 ( 1967 - ), 男 (汉族 ) ,辽宁人,副教授,副主任医师,博士,从事心血管疾病的基础与临床工作。多年来在单个心室肌细胞分离工作中, 始终存在一个方法学上困扰研究者的一个共同问题: 经胶原酶消化的心室肌细胞无法明确分辨心内膜、心外膜和中层 (M )细胞。研究表明,在对心室肌细胞的电异质性的研究中存在电生理特性不同的三种心室肌细胞,笔者试图对三种不同心室肌细胞表现在动作电位和收缩曲线上的一些特定参数进行统计分析,旨在用特定的参数从分离出混合的心室肌细胞群中区分出心室肌的心内膜、心外膜和 M细胞。1 材料与方法1. 1 单个心室肌细胞的分离 25条雄性成年杂种家犬,由美国 Oklahoma大学基础动物实验室提供。体重 20 3 kg。pentoba rbita l静脉麻醉 ( 30 mg /kg) ,静脉注射肝素 ( 100 U /kg )及心得安 ( 0. 5 m g /kg )后迅速取出心脏, 立即置于 10 , 8mmo l/L KC l的氧饱和生理液中。立即插管于冠状动脉左前降支 ( LAD )并用 Langendorff灌注系统顺序灌流: 37 生理液和无钙生理液各 10 m in, 37 含胶原酶 ( co llagenase, 1 mg /m ,lⅡ型, W o rth ington B iochem ical Co, N J)的低钙 ( 60 m o l/L )生理液 30 m in, 37 生理液 5 m in。约在灌注 3 m in co llagenase后心脏表面呈现蜂蜜样 ( H oney like) 液,为组织开始被消化的标志。将 LAD灌注的局部组织切碎成悬浮液, 并以 200 m直径孔的尼龙网过滤, 生理液反复冲洗 (约 5次 )后存放在472 中国心脏起搏与心电生理杂志 2005年第 19卷第 6期37 含青霉素的特殊生理液 ( M EM H anks, G ibco# 41600 73)中待用, 存放液 ( mm o l/L )中含有: N aHCO3 24、taur ine 10、 ribose 5、 a llopurino l 0. 1、Pen ic illin ( 100, 000 u /L ) , pH 值 7.36, 用 5% CO2平衡。1. 2 全细胞膜片钳技术 将一滴细胞悬浮液滴入温控37 , 容积为 0. 5 m l的水循环域槽内, 置于倒置的显微镜( N ikon TM S F, Japan)工作台上, 待细胞沉底附壁后, 以 3m l/m in的速度灌注生理液。工作台与一摄影机 ( P anasonicGP CD60)及视频监视器 ( Panason ic TR 124 M A)相连。选择柱状、细胞质清晰、表面无颗粒,纹理明显的细胞进行试验。直径 1. 0 mm钳片专用的硼硅酸盐微电极 (W o rld P recisionInstrum ents, Inc, PG 52150 4)用程序化电极拉制器 ( Su tterInstrum ents Co. M ode l P 87)制作。自身阻抗在 1. 5 ~ 3. 5M , 接入阻抗为 13 3 M 。轻压在细胞表面, 稍加负压即可形成 1 G 水平以上的高阻抗封接, 再用较大负压吸破细胞膜, 补偿电容电流和电极串联电阻, 形成全细胞记录形式。实验过程由 Pclam p 9. 0软件 ( Axon Instrum ents, CA )控制脉冲信号, 经数 /膜转换后由放大器输出。电流信号经 Ag /AgC l电极引导, 由膜片钳放大器 ( Axon Instrum ents, Inc.Foster C ity CA )记录并分析。1. 3 观察指标1. 3. 1 动作电位 ( AP ) 钳电流的模式下记录 AP。直立的方形脉冲阈刺激, 脉宽 3 m s,用以引发 APs。用 PCM 2 A /DVCR转换器 ( M ed ica l System s Co rp. G reenva le, NY ) 数字化AP信号, 可即时分析,并储存在录影带以便离线分析。细胞膜片钳使用仪器: A xopatch 1C un it ( Axon Instrum ents, Inc.Foster C ity CA ), TL 1 AD /DA转换器 ( LabM asterDNA, Sc ientific Solution Inc, OH ), Pentium PC ( Gatew ay2000), Pc lamp9. 0软件包 ( Axon Instrum en ts, Ca)。1. 3. 2 细胞收缩和舒张 摄影机 ( Panason icGP CD60, Panasonic Industrial Co. Secaucus, N J) 安装在显微镜 ( N ikon TW S F,N ikon, Inc. M elv ille, N J) 侧端。用光感双端探测器 ( E lectronics, UT, USA )同步记录细胞的短缩,录影带储存以便离线分析。AP和细胞收缩舒张可用可储存示波器 ( T ektron ix Inc. Beaverton, O regon, USA )和视频监视器 ( P anasonic)观察。1. 4 溶液与试剂 标准生理液成分 ( mmo l/L ) : NaC l 140. 0、KC l 4. 0、CaC l2 1. 8、M gCl2 1. 0、Na2HPO4 1. 0、4 ( 2hydroxyethy1) 1 p iperazine ethane sulfonic ac id (HEPES) 15. 0;G lucose 11. 0。无钙液: 用 M EM Joklik标准液 ( G ibco# 223000016)。标准电极内液 ( mmo l/L ): KC l 130. 0、NaC l 10. 0、ATP1. 5, HEPES 5. 0, pH 用 KOH调节至 7. 36, 37 。以上试剂均为 S igm a产品。1. 5 统计学分析 统计软件为 Jande l科学 S igm astat 5. 1。F 检验,配对 T检验和非配对性 T检验 onew ay ANOVA用以分析正态分布数据, 结果用 x s表示, m ann w hitney rank sum检验用以分析非正态分布数据, 结果用中位数表示。P < 0. 05为差异有显著性。2 结果从混杂的细胞悬浮液中任意提取 52个细胞, 每个细胞分别给予 1. 0 H z的阈刺激, 稳定状态下随机抽取记录 5个 AP。观察它们的 AP和收缩曲线的特征,发现在形态学上存在明显的差异, 其中以 AP穹隆的大小差异最为显著。故首先根据形态学的差异命名为三类不同的 AP, 分别为大穹隆 ( 18个 )、小穹隆 ( 21个 )、无穹隆 AP( 13个 )分别为图 1中的 1,2, 3组显示的动作电位。将 52个细胞在 1. 0H z刺激稳定状态下,每个细胞随机抽取 5个 AP, 并分别测量这 260个 AP的以上各项参数,见图 2。除 AP时程 (APD)为对称分布(用均数 标准差表示 )外, 其余数据均为非对称分布, 分别按相应的箱柜 ( b ins)生成柱状图 ( h istogram ) ,结果用中位数 (表 1所示 ) , 25%及 75%数值(表 1未显示 )表示, 并进行相应的统计学分析, 结果如表 1所示。三类形态学不同的细胞的收缩曲线参数: A D,D E及 E F时间 (图 2)各组间无差异 (P > 0. 05)。图 1 三类形态学不同的犬心室肌细胞动作电位和收缩曲线 1:大穹隆 AP; 2:小穹隆 AP; 3:无穹隆 AP473动作电位参数作为区分狗心室肌三种细胞的可行性研究图 2 AP和收缩曲线的测量参数 切迹的膜电位水平: B(mV) ;穹隆的膜电位水平: C (mV ) ;穹隆的高度: C B电压差 ( mV) ;尖峰切迹时间: Sp ik e B ( m s) ;穹隆上升坡度: S lope B C ( mV /m s) ; AP开始到收缩开始时间:A D (m s) ;收缩时间: D E (m s) ;舒张时间: E F( m s) ;动作电位时程: APD3 讨论近 10年来学者们对心室肌细胞的电异质性的研究取得了突破性进展。电异质性的定义为不同部位的心室肌细胞表现为不同的电活动特性以及对药物 和病理学状态的不同反应[ 1~ 3]。动物和人体心内膜、心外膜以及 M心室肌细胞的电生理和对药物反应异质性处于研究阶段。L iu和 Antzelevitch[ 4]的研究指出: 心室肌 M细胞的特点是 APD相对长和慢频率依赖性 AP时间延长的特点 (相对于心内膜和心外膜心室肌细胞 ) , 是构成电生理异质性的主体。M细胞的各离子电流分布不同于内、外膜下, 这可能是导致心室肌存在显著的跨室壁复极异质性的重要原因。心室肌 AP的异质性以及由此造成的透壁心室肌复级离散 ( TDR )是致心律失常性单向阻表 1 三类形态学不同的动作电位参数指标比较组别 例数 C B电压差 ( mV)*B( mV )*C ( mV ) Sp ike B (m s) Slope B( mV /m s)*APD (m s)1组 18 23. 3 2. 8 29. 5 13. 0 722. 5 302. 0 22. 72组 21 7. 1 24. 8 32. 3 15. 5 290. 0 357. 7 25. 33组 13 3. 1 29. 5 32. 5 16. 5 157. 5 297. 7 19. 9注:三组两两比较, * P < 0. 05;分别与 2、3组比较, P < 0. 05;与 2组比较, P < 0. 05滞和折返的重要机制[ 5]。以往的研究所谓的三种细胞是以解剖定位为基础的。研究表明, M细胞上的 IK s的电流幅值仅有内膜和外膜细胞的 1 /2, 复极时, M 细胞净外向电流减少, 复极减慢, 这就决定了 M的 APD90明显长于外膜和内膜细胞。AP的切迹 ( notch)是 4 am inopyridine敏感型短暂外向钾离子流 Ito形成的。外膜细胞 Ito的含量明显超过它在其他两种细胞的含量。引起 Ito分布差异主要是由于在心肌细胞上编码 Ito的两个基因。KV 4. 2和 KV4. 3在 M及外膜细胞上的表达明显高于内膜[ 6]。 Ito主要决定动作电位的复极1相, 所以 M及外膜的动作电位表现为突出的 1相切迹。根据以上理论, 可以将我们所观察到的三类细胞 大穹隆、小穹隆和无穹隆细胞归类为外膜、M和内膜细胞。实验结果显示大穹隆细胞比小穹隆和无穹隆细胞切迹更深, 切迹膜电位水平 (中位数 )分别为 2.75, 21. 50和 28. 50 mV。各细胞间数值无重叠,且有显著性差异,这与有关报道正常兔、大鼠、犬、猪和人类心室肌细胞 Ito在 M及外膜细胞相近, 且远远大于内膜相一致[ 7~ 9], 因此是用以区分三种细胞的可靠依据。但三种细胞却显示相似的 Ito作用时间 ( sp ike to notch tim e) , 约 14 m s。AP穹隆的形成是因为当内向电流 ICa超过 Ito的强度时, 膜电位转向去极化。大穹隆细胞的穹隆膜电位水平 ( 32. 2 mV)高于其他两种细胞 ( 27. 5 mV )。但不如 no tch水平各组间的差别显著。穹隆的上升坡度以外膜细胞最大 ( 722. 5 V /s)明显高于其他两种细胞。提示 ICa在外膜细胞的含量高于在其他两种细胞的含量。其次,穹隆的高度三种细胞也呈现显著性差异,以外膜细胞最显著。心室肌 M细胞的 APD ( 357. 7 4. 6 m s), 明显长于其他两种细胞的APD ( 323. 6 4. 1, 287. 73. 6 m s)这与 Liu和 Antzelevitch[ 4 ]的研究基本一致。M细胞较长的复极时间与 IK s在 M细胞的含量相对于在外膜和内膜细胞的含量少有关。电活动特性上的差异为我们提供了辨别三种细胞的依据。外膜、内膜细胞和 M细胞在收缩活动上的差异不显著, 表现为相似的电 机械延迟以及近似的收缩和舒张形式。心室肌三种细胞本无解剖学分界线,在心室肌细胞分离的过程中,因为胶原酶的消化作用使得三层细胞几乎融为一体而无法分辨。但不同细胞在AP特性上的显著差异为研究心室肌细胞电异质性的方法学提供了可靠依据。目前的研究提出心室肌 M 细胞的分布并非呈整齐的层状,而是呈岛形分布。因此,从解剖学角度474 中国心脏起搏与心电生理杂志 2005年第 19卷第 6期分辨心室肌细胞的种类存在局限性, 我们从混合的心室肌细胞电生理特性上研究三种细胞间的区别,试图用 AP某些参数作为区别三种细胞的标准。这种以电生理特性为根据的分类方法与解剖学分类不一定有完全的对应关系,但从研究性质上看,电生理分类可能更准确、更易于理解心律失常的性质。心外膜细胞切迹膜电位水平最低,穹隆幅度最大,穹隆上升速度也最大。M细胞 APD最长,穹隆大小介于心内膜和心外膜细胞之间。心内膜细胞几乎无切迹和穹隆, 且与心外膜细胞具有相似的APD。狗心室单个细胞 AP的参数, 如切迹和穹隆的膜电位水平、穹隆高度、穹隆上升速度及 APD可以作为辨别心内膜、外膜、M 细胞的依据。因此可以省略解剖学分辨三层心肌细胞的过程, 在分离出单个心肌细胞后直接以 AP的特性进行区分。参考文献1 An tzelevitch C. TheM cel.l Invited ed itorial comm ent[ J] . J Card iovasc, Pharm acol Ther, 1997, 2: 732 An tzelevitch C, S icou ri SH, Litovsky A, et a.l H eterogeneity w ith inthe vent ricu lar w al:l E lectrophys iology and pharm acology of ep icardia,l endocardial and M cel l[ J] . C irc Res, 1991, 69: 14273 Anyukh ovsky EP, Sosunov EA, Ca inu ll in RZ, et a.l The controversialM cell[ J] . J C ard iovasc E lectrophys io,l 1999, 10: 2444 L iu DW, An tzelevitch C. Characterist ics of the delayed rect ifier curren t ( Ikr and Iks ) in can in e ven tricu lar epicard ia,l m idmyocard ialand endocard ialmyocytes: A w eak er Iks contribu tes to the longer act ion poten t ial of th eM cell[ J] . C irc Res, 1995, 76: 3515 Francis LB, Stuart MC. Disp ersion of ventricu lar repolarizat ion andrefractory period [ J]. C irc Res, 2001, 50: 106 Anyukh ovsky EP, S osunov EA, Rosen MR. R egional d ifferences inelectrophys iological prop erties of ep icard ium, m idm yocard ium, andendocard ium. In vitro and in vivo correlations[ J] . C ircu lat ion, 1996,94: 1 9817 G intan tGA. Region al d ifferen ces in IK den sity in can ine left ven tricle: Role of IK, S in electrical heterogeneity[ J] . Am J Phys io,l 1995,268: 6048 H uang B, Q in D, E l Sh erifN. Spatia l alterat ions ofKv chann els exp ression and K+ cu rrents in pos tM I remodeled rath eart[ J] . C ard iovasc Res, 2001, 52: 2469 Anyukh ovsky EP, Sosunov EA, Feinm ark S J, et a.l E f fects of gu in id in e on repo larization in can in e ep icardium, m idm yocard ium, and endocard ium: II. In v ivo study[ J] . C ircu lation, 1997, 96: 4 019( 2005- 04- 25收稿 )(向晋涛编辑 )2005年欧洲心脏学会年会报道概况余国膺欧洲心脏病学会 2005年年会于 9月 3~ 7日在瑞典斯德哥尔摩市召开。参加者近 20 000人。收到交流论文摘要 9 000余篇。会议的组织格局基本与历届相似。今年的一个特色是学术交流与 ESC创建的《W omen at H eart》相结合; 另一特点是:设专题诠释新公布的欧洲心力衰竭 (简称心衰 )指南; 设专题讨论心衰的再同步、起搏除颤、抗血小药物、心衰病人体力锻炼等临床问题。基础方面, 对干细胞、细胞治疗心脏肥大、重塑等时下热点。组织多场专题交流与讨论, 内容更贴近实际, 有助于研究者们考虑得失, 跨出清楚的下一步。《W om en at H eart》与美国的《Go Red fo rW om en》遥相呼应。通过流行病学、临床诸方面大量调查和分析,学者们发现心血管病的男、女之别,发现了知识盲区。从学会的角度,组织《W om en at H eart》、《Go Red fo rW om en》呼吁加强妇女心血管病的关注。它们是知识转换为社会效益, 研究成果转换为行动的具体表现。用我们习用的话说, 是科研为经济建设服务的具体途径。学会在其中起中心作用, 而学会是由科学家组成的。妇女心脏病虽然不是全新的问题,但性别之差开拓心脏学的一个新的领域, 将带来概念的改变、学科的深入,带来诊疗水平的提高。催生《W om en a tH eart》的流行病学、临床研究, 并非尖端技术,其结果能够发挥很好的社会功能。这使我联想起不久前荣获本年度诺贝尔的幽门螺杆菌。蛋白质时代, 病原微生物研究已不再占医学研究的主流位置。与分子生物学、干细胞、细胞因子等领域比,已冷落多时,许多人眼里, 已远离 时尚 , 最平凡不过。它的获奖再次昭示 :医学研究需要各个不同层面的钻研。关键能否推动学科进步,使人群受益。475动作电位参数作为区分狗心室肌三种细胞的可行性研究

动作电位参数作为区分狗心室肌三种细胞的可行性研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/18119/%e5%8a%a8%e4%bd%9c%e7%94%b5%e4%bd%8d%e5%8f%82%e6%95%b0%e4%bd%9c%e4%b8%ba%e5%8c%ba%e5%88%86%e7%8b%97%e5%bf%83%e5%ae%a4%e8%82%8c%e4%b8%89%e7%a7%8d%e7%bb%86%e8%83%9e%e7%9a%84%e5%8f%af%e8%a1%8c%e6%80%a7%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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