肠激酶(EK,EC 3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶.以小分子荧光物质Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-萘胺为底物,采用荧光跟踪法研究了变性剂盐酸胍、硫脲、尿素对重组牛肠激酶(rEK)活力的影响及抑制动力学.结果表明:盐酸胍、硫脲、尿素均对该酶的活性有较强的抑制作用,它们对该酶的半抑制浓度(IC50)分别为0.025,0.080和0.750 mol/L.研究的3种变性剂对该酶的抑制均显示可逆抑制机理;抑制类型也均为竞争性类型,测定它们对酶的抑制常数KI分别为0.015,0.060和0.553 mol/L

孙黎

李智聪

杨美花

郑丽钦

陈小兰

陈清西

Xiamen University Institutional Repository

第 50 卷 第 3 期 厦门大学学报(自然科学版) Vol. 50 No. 32011 年 5 月 Journal of Xiamen U niversity ( Natural Science) May 2011变性剂对重组牛肠激酶活性的影响陈小兰1,杨美花1, 2,李智聪1,郑丽钦1, 2,孙 黎2,陈清西1*( 1. 厦门大学 生命科学学院,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建 厦门 361005;2.厦门特宝生物工程股份有限公司,福建 厦门 361022)收稿日期: 2010 05 17基金项目:国家基础科学人才培养基金项目( J 1030626 ) ;厦门市科技创新项目( 3502Z20081143)* 通信作者: chen qx@ x mu. edu . cn摘要: 肠激酶( EK, EC 3. 4. 21. 9) 是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶 . 以小分子荧光物质 Gly Asp AspAsp Asp Lys 萘胺为底物, 采用荧光跟踪法研究了变性剂盐酸胍、硫脲、尿素对重组牛肠激酶( rEK )活力的影响及抑制动力学. 结果表明: 盐酸胍、硫脲、尿素均对该酶的活性有较强的抑制作用 , 它们对该酶的半抑制浓度( IC50 )分别为0. 025, 0. 080 和 0. 750 mol/ L . 研究的 3 种变性剂对该酶的抑制均显示可逆抑制机理; 抑制类型也均为竞争性类型, 测定它们对酶的抑制常数 K I 分别为 0. 015, 0. 060 和 0. 553 mol/ L .关键词:变性剂; 重组牛肠激酶;动力学; 抑制作用中图分类号: T Q 925. 4 文献标志码: A 文章编号: 0438 0479( 2011) 03 0603 04肠激酶( enterokinase, EK, EC 3. 4. 21. 9)是哺乳动物消化系统中最基础的丝氨酸蛋白水解酶之一, 由一条结构亚基(重链)和一条催化亚基(轻链)构成, 两者通过一个分子间二硫键结合. 结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动, 催化亚基可以特异性识别胰蛋白酶原中Asp Asp AspAsp Lys序列并沿序列的羧基端切下,将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶,从而启动各种酶原活化的级联[ 1] .对于 EK酶切的高度特异性, Rumsh 等[ 2]认为是由于酶中钙离子的丧失使得酶自切割, 从而具备了激活其他酶的高度特异性. Janska 等[ 3]研究氨基末端残基发现了 EK轻链的三维结构与类胰蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶的结构同源性. Song 等[ 4] 则发现将轻链氨基末端的Ile突变为 Val其酶活几乎不发生改变. 有研究[ 5 6]发现 EK的重链强烈影响 EK 对大分子底物的识别, 而对合成的融合蛋白或小分子底物的识别没有影响. 重组牛肠激酶 ( r ecombinant bovine enterokinase, rEK)的分子质量通常为 26. 3 ku,具有 3个糖基化位点[ 7] ,其糖基化分子质量大约为 43 ku. Vozza 和 Lisa 等[ 7 8]先后报道了用大肠杆菌( Escher ichia coli )和甲醇酵母制备 rEK 的方法, 另外, Vozza等[ 7]发现, r EK体外实验证明有全酶酶切特异性并且相对于天然 EK 表现出对基因工程融合蛋白底物的酶切活性增强, 因而现在多采用基因工程的方法生产 rEK.本文应用酶动力学方法,探讨几种常用蛋白变性剂(盐酸胍、硫脲、尿素 )对 rEK 催化 Gly Asp AspAsp Asp Lys 萘胺( GD4K 萘胺)水解反应的影响,探讨其作用机理,该研究对于其作为工具酶应用于基因工程产品的生产、应用方面具有重要的指导意义.1 材料与方法1. 1 材 料rEK 由厦门特宝生物工程股份有限公司提供;GD4K 萘胺为 Sigma 产品; 盐酸胍、硫脲、尿素均为国产分析纯试剂;实验用水为超纯水.1. 2 方 法1. 2. 1 rEK 活力的测定参照文献[ 9 10]方法, 以 GD4K 萘胺为底物,在rEK作用下,底物水解会释放出具有荧光的 萘胺,激发光波长为 331 nm, 发射光波长为 420 nm , 采用Max M 2e荧光酶标仪和 Costar 荧光酶标板测定.具体测定方法是:在 200 L pH 8. 0的 Tris HCl缓冲体系中,以 0. 10 mmol/ L GD4K 萘胺为底物, 加入 20 LrEK酶液,在 25 恒温下跟踪荧光值( F )随反应时间的变化,从直线斜率计算酶活力.活力单位定义为在上述测活条件下,每秒引起的荧光强度增加 1个单位的酶量.1. 2. 2 效应物对 rEK活力的影响在固定底物浓度为 0. 10 mmo l/ L 的测活体系中,分别加入不同浓度的效应物, 以未加入效应物为100%的酶活力,计算酶的剩余活力, 考察效应物对该酶活力的影响, 效应物的抑制强度以导致酶活力下降50%所需的抑制剂浓度( I C50 )表示.1. 2. 3 效应物对 rEK抑制机理的判断在固定底物浓度为 0. 10 mmo l/ L 的测活体系中,改变 rEK 的加入量, 测定不同浓度的效应物对 rEK催化底物水解的酶活力的影响, 以酶活力对酶量的浓度作图,判断效应物对 rEK的抑制机理.1. 2. 4 效应物对 rEK抑制类型及抑制常数的测定在固定 rEK 质量浓度为 2 g/ mL 的测活体系中,改变底物的浓度, 测定不同浓度的效应物对 rEK催化底物水解的酶活力的影响. 以 Linew eaver Burk双倒数作图,比较酶催化反应的动力学参数, 包括表观米氏常数( K m )和最大反应速度( Vm )的变化来判断变性剂对 rEK的抑制类型.2 实验结果2. 1 盐酸胍、硫脲、尿素对 rEK活力的影响在25 、pH 8. 0的测活体系中,固定底物浓度为0. 10 mmol/ L 和 rEK质量浓度为 2 g/ mL, 以不加效应物为对照, 测定不同浓度的盐酸胍、硫脲、尿素对rEK活力的影响, 结果如图 1所示. 实验结果表明, 3种蛋白变性剂均对酶活力有较强的抑制效应,其中尿素的抑制活性最弱, 其 I C50为 0. 750 mol/ L; 硫脲次之,其 I C50为 0. 080 mol/ L ; 盐酸胍的抑制活性最强,其 I C50为 0. 025 mol/ L, 当盐酸胍浓度达到 0. 050mol/ L 时, 酶活力下降 75% .2. 2 盐酸胍、硫脲、尿素对 rEK的抑制机理及抑制常数的测定在 25 、pH 8. 0测活体系中,固定底物 GD4K萘胺浓度为 0. 10 mmol/ L, 改变 rEK 的加入量, 测定不同浓度盐酸胍对该酶活力的影响. 以酶活力对酶蛋白的浓度作图, 得到一组通过原点的直线, 结果如图 2所示.随着加入的盐酸胍浓度增大,直线的斜率逐渐下降,说明盐酸胍对该酶的抑制作用属于可逆过程, 增加盐酸胍浓度导致酶活力的下降是通过抑制酶活力降低催化效率,而不是通过导致有效酶量的减少而引起酶活力的下降.硫脲、尿素对 rEK 的抑制机理与盐酸胍类似,也是随着加入硫脲、尿素浓度的增大, 直线的斜率逐渐下降,也属于可逆过程.曲线 1~ 3 分别表示盐酸胍、硫脲、尿素.图 1 盐酸胍、硫脲、尿素对 rEK 活力的影响F ig . 1 Inhibito ry effects on activ ity of rEK o f GuanidineH ydrochlo ride, thiourea and urea直线 1~ 6 盐酸胍浓度分别为 0, 5, 10, 15, 20和 25 mmol/ L .图 2 盐酸胍对 rEK 抑制机理的判断F ig. 2 Inhibito ry mechanism of Guanidine Hydrochlo rideon rEK在 25 、pH 8. 0 测活体系中,固定 rEK 质量浓度为 2 g/ mL, 改变底物 GD4K 萘胺浓度, 测定不同浓度盐酸胍对 rEK 活力的影响. 根据盐酸胍对 rEK抑制作用的 Lineweaver Burk 图, 得到一组相交于纵轴的直线, 结果如图 3所示,说明盐酸胍对 rEK 的抑制只影响酶促反应的K m, 不影响Vm ,其抑制机理表现为竞争性类型, 以不同浓度盐酸胍求得的 K m 对抑制剂浓度二次作图(图 3内插图) ,求得盐酸胍对 rEK 的抑制常数 K I 为 0. 015 mol/ L. 硫脲、尿素对该酶的抑制机理与盐酸胍类似, 其抑制常数 K I 分别为 0. 060和 0. 553 mol/ L . 现将 3种变性剂的抑制动力学参数列于表 1.3 讨 论EK的底物酶切位点序列具有高度的特异性, 这604 厦门大学学报(自然科学版) 2011 年直线 1~ 5 的盐酸胍浓度分别为 0, 5, 10, 20, 30 mmol/ L .图 3 盐酸胍对 rEK 活力抑制作用的 L inew eaver Burk 图Fig. 3 L ineweaver Burk polts for inhibition ofGuanidine H ydrochlo ride on rEK activity表 1 不同变性剂对 rEK 催化反应的动力学参数T ab. 1 K inetics parameters o f rEK at different denaturant变性剂 IC50/ ( mo l L - 1 ) 抑制类型 K I / ( mol L- 1)盐酸胍 0. 025 竞争性 0. 017硫脲 0. 080 竞争性 0. 060尿素 0. 750 竞争性 0. 553种特点使得 EK成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具而被广泛应用[ 11] . 目前, 该酶主要是通过毕赤酵母重组表达生产, 不同的提纯工艺对酶的活力有很大的影响, 然而,生产中各因素对酶活力的影响报道并不多. 郑丽钦等[ 12] 的研究表明赖氨酸、异丙醇、乙腈、丙酮、EDTA 和 DT T 均对 rEK 有不同程度的抑制效应.本文以荧光物质 GD4K 萘胺为底物,采用荧光跟踪法研究了几种常用蛋白变性剂对 rEK 活力的影响. 研究结果表明, 3种变性剂盐酸胍、硫脲、尿素对rEK 活力均有不同程度的抑制作用, 其半抑制浓度( I C50 )分别为 0. 025, 0. 080和 0. 750 mol/ L. 酶动力学研究表明, 3种变性剂均为竞争性的可逆抑制剂,并求得其抑制常数.本文深入探讨了 3种变性剂的抑制作用机理,从理论上阐明了效应物的抑制机理和类型, 为寻找其他的对该酶有抑制活性的效应物提供理论依据.在基因重组药物生产实践中, 盐酸胍、硫脲、尿素均为常用的变性剂, 本研究结果表明, 变性剂的使用浓度对 rEK 活力有较大的影响, 对生产实践有一定的指导作用.参考文献:[ 1] 查向东,孔小卫, 周立志. 牛肠激酶次特异性识别序列分析[ J] .安徽农业科学, 2003, 31( 5) : 708 709.[ 2] M ikhailov a A G, Rumsh L D. Structural character isticsprov iding for high specificity of enteropeptidase [ J ] .Bioor g Khim, 1998, 24( 4) : 282 287.[ 3] L ight A, Janska H . T he amino terminal sequence of thecataly tic subunit of bov ine enterokinase [ J] . Journal o fPr otein Chem, 1991, 10( 5) : 475 480.[ 4] Song H W, Cho i S I, Seong B L . Eng ineer ed recombinantent eropept idase cataly tic subunit: effect of N terminalmodification[ J] . A rch Biochem Biophys, 2002, 400( 1) : 16.[ 5] Lu D , Yuan X, Zheng X, et al. Bov ine proenteropeptidaseis activ ated by tr ypsin, and the specificity o f enteropeptidase depends on the heavy chain[ J] . Bio Chem, 1997, 272( 50) : 31293 31300.[ 6] 顾玮彦, 袁磊, 徐志南, 等. 利用 his tag 纯化和复性基因工程产物肠激酶[ J] .食品与生物技术学报 , 2006, 25( 6) :18 22.[ 7] Vozza L A , W ittw er L, H igg ins D R, et al. P roduction of arecombinant bov ine enter okinase catalyt ic subunit in themethylotr ophic yeast P ichia pasto ris [ J] . Nat ur e Bio techno lo gy , 1996, 14: 77 81.[ 8] Collins Racie L A , McColgan J M , Grant K L , et al. Pr oduction of recombinant bovine enterokinase catalyt ic subunit in Escher ichia coli using the novel secreto ry fusionpartner DsbA [ J] . Nature Bio technolog y, 1995, 13: 982987.[ 9] Peng L S, Zhong X F, Ou J X, et al. H igh lev el secreto ryproduct ion of r ecombinant bov ine enterokinase light chainby P ichia p as tor is [ J] . Journal of Bio technolog y, 2004,108: 185 192.[ 10] 孙自勇, 陈均勇, 陈新园, 等.牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定[ J] . 南京大学学报: 自然科学版, 2004, 40( 1) : 41 48.[ 11] 张向辉, 谭树华,李泰明 .肠激酶特点及其基因工程的研究进展[ J] . 药物生物技术, 2005, 12( 5) : 347 350.[ 12] 郑丽钦, 杨美花, 潘志针, 等.效应物对牛肠激酶活性的影响[ J] .厦门大学学报 :自然科学版, 2009, 48( 5) : 725728.605第 3 期 陈小兰等:变性剂对重组牛肠激酶活性的影响Effects of Different Denaturant on Recombinant Bovine EnterokinaseCHEN Xiao lan1, YANG M ei hua1, 2 , L I Zhi cong1 , ZHENG Li qin1, 2 ,SUN Li2, CHEN Q ing x i1*( 1. Key Labor ator y o f the M inistry of Education fo r Cell Biolog y and T umo r Cell Eng ineering ,School o f L ife Sciences, X iamen Univ ersity , X iamen 361005, China;2. Amoy top Bio technique Company of X iamen, Xiamen 361022, China)Abstract: Enterokinase( EK , EC 3. 4. 21. 9) is an impo rtant enzyme w idely used in gene engineer ing . I n this study , the inhibito ryeffects of sever al denaturant guanidine hydrochlo ride, thiourea and urea on the activ ity of rEK for the hydro lysis of G ly Asp AspAsp Asp Lys naphthylamide w ere invest igat ed by the monit or ing the change of fluo rescence. T he r esults indicated that guanidinehydrochlo ride, thiourea and urea had str ong inhibitor y effect on the activity of rEK , wit h the concentrations of 0. 025, 0. 080 and0 . 750 mo l/ L , respectively leading t o 50% enzyme activity lo st . Research show ed that the mechanism of guanidine hydrochlo ride,thiourea and urea effect ing on rEK activity w ere r eversible, belonging to competetiv e type inhibitor y . T he inhibit ion constants o fguanidine hydrochlo ride , t hiourea and urea were r espectively 0. 015, 0. 060 and 0. 553 mol/ L .Key words: denatur ant; r ecombinant bovine enterokinase; kinetics; inhibition简 讯2010年度我校获国家、部、省、市级科技奖项目序号 项目名称 获奖类别 获奖等级1 戊型肝炎病毒优势构象性抗原决定簇的发现及其在诊断中的应用 国家科学技术奖 2 等2 细胞坏死分子机制的研究 高等学校科学研究优秀成果奖 1 等3 海洋微型生物碳泵 中国高等学校十大科技进展4 海洋桡足类滞育生物学研究 海洋创新成果奖 2 等5 眼表上皮疾病的基础与临床研究 福建省科学技术奖 1 等6 非线性退化抛物方程与 Nav ier St okes 方程的边界层问题 福建省科学技术奖 2 等7 煤炭分布式智能生产执行系统 MES 研制与应用 福建省科学技术奖 2 等8 多晶硅连续凝固铸锭产业化工艺与设备 福建省科学技术奖 3 等9 胃癌生长方式、临床病理特征的研究及应用 福建省科学技术奖 3 等10 Brugada综合征心电学及心脏超声影像学特征及相关性研究 福建省科学技术奖 3 等11 角结膜疾病的基础研究及临床应用 福建省科学技术奖 3 等12 医用全身扩散加权成像及其在肿瘤转移灶诊断中的应用 厦门市科技进步奖 1 等13 角结膜疾病的基础研究及临床应用 厦门市科技进步奖 2 等14 运用数理方法研究代谢综合征中医证型的分类及其特征 厦门市科技进步奖 2 等15 寰枢关节及椎动脉三维 CT 的影像解剖与临床应用 厦门市科技进步奖 2 等16 煤炭分布式智能生产执行系统 MES 研制与应用 厦门市科技进步奖 3 等17 异基因造血干细胞移植治疗血液病临床研究 厦门市科技进步奖 3 等18 乙型肝炎病毒前前 S 区和前 X区与肝细胞癌关系的研究 厦门市科技进步奖 3 等19 汽车工业用 MEMS 传感器的研发和产业化及微纳制造产业化平台的建设 厦门市科技进步奖 3 等20 BE 上皮内瘤变 腺癌序列和鳞癌微卫星改变及临床意义 厦门市科技进步奖 3 等厦门大学科技处606 厦门大学学报(自然科学版) 2011 年

变性剂对重组牛肠激酶活性的影响

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