以电化学聚合法在石墨电极上获得可作为免疫电极膜材料的聚间苯二腹膜，应用戊二醛Z联法，将抗乙型肝炎表面抗体（Hhab）共价交联于膜上，制成免疫电极。测定乙肝表面抗原（Hhag）的响应时间仅需swhn，最佳测定波州为8刀，电极线性范围0．125～O．32ng7ndmp。不同批电极间相对标准偏差为3．31％，具有较好的重视性和选择性。4℃不可保存半年以上，同一电极可重复使用15次以上。临床检测60例血清样品，并以酶联免疫吸附检测法（ELISA）结果为对照，显示免疫电极测定法的敏感性为86．1％，特异性为100％

万桢

卢方

李东辉

陈瑞川

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分 析 仪 器 19 9 8 年第 2 期8 : 5 907 苏永选,周振,杨亢原,王小如,黄本立.分析仪器,19 7,(3 ) : 138 加 Y X,Y歇瑶 P Y,Ch en D Y,Zhan g Z G,W ax 堪 XR,H 崔叮心 B L.J A门a1 Ai 物洲二打刀m,19 97,(8 ) :8 179 苏永选,杨兀原,谢永明,李福民,谷胜,王小如,黄本立.厦门大学学报 (自然板),19 98,(2 )收稿日期: 19 9 7 一 12 一 0 5C加口钾比佣 健由别口比奴犷七n cs of 而c找曰戈. 记·p u卜七 g】洲 d如由. r罗 胡d d加eC t 。口比℃n t gl懈 d场由ar 罗 as i皿, 扣p 以污【份 t访卜of- n妙 tn . 贬‘ s脚比tn . 甘匀,S u 奎访泣多双姐 n,Ya ng 只, g 终姐n ,乃ou Z矢en,瓜凡m 动,不粉ng X 如~,月白口ng五卜刀21 (及和时刀沈刀￡of 以e7n 说ry,孟召加m 句ry of A,妇恤。l& 艺enCe , X 勿~ Uni~ty,x 勿~,36 1卯5 )The c ha . et已ri stics of 而~d一Pu晚 glow di 、抽琅e(降 pulse CD ) 朋d d ir ect~ ent g low d改卜叮ge (dc一G D ) as。~of tir n 已of- 碗hi ~s户沈 t~ 卿(T C下M S ) are ~p 叮曰.T he vol ta g已~t e ha .e teristics of twodi s-c 卜叮g e m 记es an d t比e ff改ts of di sc h 叮ge 侧叮田刀 e to of d o G D ,tha in t~ ty of ~si g n a ls are disc 建妇翻.T he~5 户沈廿a 由面n曰 初th d o G D an d 片p ul se G D are given.E x详 , m en talres ul ts sbo w tha t 降 p川se G D is ~su ita bl e forT O FM S thall dc- Gd an d l璐 pn j nu si ng fo ti 叮e in tha fi目ds of dir ec t 印Iid an al 归5 an d su 到Fae e d eP thar犯1归 s.聚间苯二胺膜 乙肝免疫电极 的研制陈瑞川 卢 方 李东辉 万 祯(厦 门大学抗癌研究中心,厦门,3 6 l0() 5 ) (厦门大学化学系,厦门,3 6 1(X) 5 )摘 要 以电化学聚合法在石墨电极上获得可作为免疫电极膜材料的聚间苯二胺膜,应用戊二醛迈联法,将抗乙 型肝炎表面抗体 (H氏八b) 共价交联于膜上,制成免疫 电极。测定乙 肝表面抗原(班犯气g ) 的响应时间仅需 8而n , 最佳测定液州 为 8.0,电极线性范围 0.125 一 0.32 阳乃1 1L H 3 八g。不同批电极间相对标准偏差为 3.31 %,具有较好的重现性和选择性。4℃ 下可保存半年以上,同一电极可重复使用 15 次以上。临床检测 60 例血清样品,并以酶联免疫吸附检测法 (E LI SA ) 结果为对照,显示免疫电极测定法的敏感性为 86.1 %,特异性为 10 %。关键词 乙肝表面抗原 免疫电极 间苯二胺应用于传感器的生物活性膜多采用 固定化包埋技术,将生物活性材料交联或包埋在化学膜材料上 [l, 2〕。常用作免疫 电极的化学膜材料有醋酸 乙烯膜闭、聚氯 乙烯膜 [’]、聚苯 乙 烯膜 [s] 等。生物活性材料大多依赖物理吸附结合在膜上,免疫电极制备方法复杂,难以重复使用。本文采用 电化学聚合方法,在抛光 了的石墨电 极 表 面 获 得 结合 牢 固 的 聚 间 苯 二 胺(PD A ) 膜。该膜本身具有 电导性,并存在游离氨基,可用戊二醛活化后再与抗乙型肝炎表面抗 原 (HBsAg ) 的抗体 (H 压Ab ) 共价 交联。抗体结合牢固,制成的免疫电极可重复使用。由于电化学聚合法制备 PD A 膜的方法简便,制备条件容易控制,制成的免疫电极重现性好,因此 PD A 膜可望成为一 种新 型免疫电极膜材料。一、实验部分1,电化学聚合 PD A 膜的制备以抛光的光谱纯石墨电极 为研究电极,铂19 8 年第 2 期 分 析 仪 器电极 为对 电极,电池 电压 控制在 2.5V,在0.12 mo l几 PD A (上 海 白 鹤 化 工 厂 ) 的1.2rno l几 硫酸溶液 中电聚合 20 而n。取 出电极,双蒸水洗净,凉 干后 4℃ 下 避光 干燥保存。2. 托Bs A b 免疫电极的制备经上述方法制备的电极,15 ℃下在 3 % 的戊二醛 (进 口分装 ) 溶液 中浸 泡活化 4 h。取出电极,用 双蒸水洗净,置 于 H 氏八b 溶 液(本单位免疫学研究室提供,14 乃m g几,滴度1 : 1 2 8 ) 中,4℃交联 2 4 h。最后置于 1 % 的牛血清 白蛋 白 (上 海华美生 物工 程公 司 ) 中,4℃下封闭 2 4 h,用磷酸盐缓冲液 (0.lrno l几,pH7.2) 洗净,室温下 凉干,4℃干燥避光保存备用。3.实验装里实验装置主要由免疫电极系统和电信号处理测量系统组成,包括 PX S 一 2巧 型离子活度计,免疫电极,饱和甘汞电极,测量池,恒温磁力搅拌器。图 1 是实验装置示意图。待测 样 品的 H氏A g 含量。实验均重 复 3 次,取平均值。二、结果与讨论1.动力学晌应 曲线图 2 所示为乙肝免疫电极对 H Bs A g 的动力学 响应曲线。样 品为 H Bs Ag 阳 性血 清及H Bs A g 阴性血清。扮E山心反应时间 ( m sn )圈 2 免痊电极时间 一 电位曲线a.H压Ag 阳性血清b.1亚目龟阴性血清图 l 实验装里示意图4.实验方法使用前,先将免疫电极放 在 0.lm o l几 磷酸盐缓 冲液 ( PBS,pH S.0 ) 中浸 泡 3 一 4 h,使之平衡。在测量池 中加人该 PBS,测定其电位值,作为基数。再测定 I丑弘A g 阳性或阴性待测血清样品 (血清均 以该 PBS 稀释 10 倍 )的电位值,得两电位值之差 (业),从而得出由图可见,阳性血清样品 的反应曲线a在测定时间范围内可分为两个阶段。第一阶段为一级响应阶段,随着时 间 的延 长,样 品中的H Bs Ag 迅速与电极膜上的 H Bs A b 结合,形成免疫复合物,使电极表面电荷重新分布,电位正移,呈线性上 升。第二阶段为混合响应阶段,至 8而n左右,抗原 一 抗体结合速率明显下降,电极电位变化值呈非线性上升。故本文后继实验均采用反应 smin时的电极 电位值。阴性血清样品响应曲线 b 显示的电极电位变化(业) 为负值。据此可方便地识别 出 H Bs A g阳性或阴性的待测血清样品。2. p H 对免疫电极晌应的影响以不同 pH 值的 PBS 稀释血清样品,再添加 H氏八g 标准疫苗,检测 电极 电位变化值。测定液 州 值为 8.0 一 8.5 时,电极电位变化分 析 仪 器 1998 年第 2 期值 (业 ) 最大。故 选择 pH 为 8.0 的 PBS 作为血清稀释液。pH 对电极响应的影响见图 3。日日山心>日心山7.5 8 8. 5 10 1 2必0.2 5 0.7 5 1。25 1.75吮 (印玉满日) (x 10一 ,愧乃. L)图 4 电位 一 1”贻Ag 浓度晌应曲线图 3 PH 对电极晌应的影晌3.抗原浓度响应曲线用 PBS 将阴性血清稀释 10 倍后,添 加H Bs Ag 标准疫苗,配制成系列 浓度的 H 致产g样品,检 测结 果见 图 4。H l弘掩 抗 原浓度 在0.12 5 一 3.2 0拌g 八n L 范 围内线性 良好,响应 曲线 的线性方 程 为: y = 4.2 3 x + 0.5,斜 率为4.2 3。据此方程可对 H 压八g 进行定量检测。4.重现性用不同时间制备 的不 同批号 的免疫 电极,对 同一浓度 的 H B sA g 血 清样 品进行检测,然后将电极置 于 0.2mo l几、pH2.8 的甘氨酸一盐 酸缓冲液中浸泡 sm in,洗脱结合的 H Bs A g,凉干后,4℃ 干燥保存 6 个 月,再进 行同样 的检测,每个样 品重复检测 3 次,取平均值,结果见表 1。表 1 免疫电极的孟现性试验不同批号电极检测结果 (m V )1 2 3 4 5 6么E 士 S【) R反 ) ( % )首次检测 望7 79 74 ()o6 3.84+ 0.1 6.5 6 + 0.14,末次检测 在 6 个 月后进行。(Auz)山批 间 △E 的 相 对 标 准 偏 差 ( R S D ) 在3.3 1 % 一 3.0 7 % 之间。4℃ 保存 6 个 月后,免疫 电极尚具有 原始 HBSA g 活性的 94.2 %,表明本法制备的免疫电极重现性较好,交联固定的抗体稳定性较高。5.重复性和选择性以同一电极对 同一浓 度的 比3SA g 血 清样品进行检测,每检测一个样品后 即于甘氨酸一盐酸缓 冲液 中洗脱结合的 H BSA g,再进行 检测,反复检测 4 0 次,结果见图 5。由图可见,在连续检测 20 次后,电极仍有 95 % 左右的抗体活性,此后活性衰减速度加快,至 4 0 次后抗体活性为原活性的 4 0 % 左右。10 2 0 30 冷0次数图 5 免疫电极重复试验以免疫 电极 对 含 乙 肝e抗原 ( H 氏八g )、甲肝疫苗及丙肝抗原的血清样品进行检测,其19 8 年第 2 期 分 析 仪 器响应动力学曲线与 1.1 戈A g 阴性血清 一致,表明免疫电极有较好的重复性及选择性。6.临床样品检测按实验方法对 60 份 临床采集的血清样品进行检测,判断标准为,△E ) 0 为阳性,△E< 0 则 为 阴 性 ; 另 以 酶 联 免 疫 吸 附 法(E LI SA,厦 门新创公 司产品 ) 进行双盲平行检测,结果见表 2o表 2 部分血清样品双盲试验结果样品号 4 5 56 5 7 58 5 9 60本法 (山n V ) 1.5 8 一 0.6 一 0.2 一 0.8 一 0.9, 十 为阴性血清, 一 为阴性血清。E LI SA 检测为阳性的 36 例中,免疫电极法检测 31 例为阳性,另 5 例为阴性,敏感性为86.1 % (31 乃6) ; E LI SA 检测为阴性的 2 4 例,免疫电极法检测也为阴性,其特异性为 100 %(24 忍4),两法基本相符。结果见表 3。表 3 EL贬涛法与免疫电极法结果比较检侧方法E LIS A 法阳性 阴性 总计使用,降低了检测成本。由于本工作采用的是普通离子计,检测低浓度 H压八g,灵敏度尚不够高。另外所用 的H 压八b 是粗制抗体,因此检测 H 压Ag 的低限仅为 0.12 5阳乃爪L。若对电信号检测及处理系统作改进,提高检测灵敏度,并采用亲和纯化抗体,可望进一步提高检测灵敏度。免疫电极法.363 l2 42 4 + 5.60叨 参考文献, E L IS A 法检侧为阳性的 36 例样品中有 5 例免疫电极法检侧为阴性。7.结 论电聚合 PD A 膜易于制备,适合批量生产,适于作免疫电极膜材料。本法检测 1丑弘A g,操作简便、快速,8而n 即可得出结果,且特异性高。批间电极检测 的 △E 及绝对电位值差异均较小 (批 间 电极检测 绝 对 电位值 的 R S D< 4.5 1 %,数据未列 出 )。此外,电极可 重复l 李凡超等.分析化学,19 94,2 2 (1) : 552 孙裕生等.分析仪器,19 7,(2 ) : 123 山本直登等,国外医学免疫学分册,19 82,5 (2): 9 24 段此ky R L et al.八门习 C卜im A eta,198 1,12 3 (2 ): 1355 苏殿杰等.生物化学与生物物理进展,1985,(6): 7 3收稿日期: 1997 一 06 一 29巧哟冲邝ti佣 of 州界仪对co p hen ylend运m i说~bn 业犯 h e钾tit is B in ul 扣 n倪】ec tr 以k.以。 Ruich uan , L u凡ng,Li 肠力g h u i (伍~R~ rch o刀ter,叉班d~ Un￡~ity,x 必~,36 1佣5 ),”乞n 乃en (1再介zrt~tof以成说ry,X 动~ Uni~ty,X 泛口~,3 61 即5 )A~tyl 祀 of 卜, titis B 让田的山oe lec t双刁e~p re哪r团 for det ect呢 hePa ti is Bs让d aee an tlg e n (1卫弘A g ).T 书eh e阳 ti is B su H a e e an ti lx x」y (H压流B ) ~c~1让Lk ed to po lyTn erio m一p hen 贝en di ~ ne (PD A ) m em brane w hi ch ~俪丽司 by d ec tn 耳幻1帅ex 习过ng PD A on to the su ri治ce of gr’a phi te el ec t获沮e.T hee x 详川m e n 已 ~ ltss比w 团 廿以 山ere 不幻幻。e t~ oft比 d ec 切川e~8 而nu tes an d the rec tilnearra n g e~0.12 5 一 3.2 0咫八11L.T h e R SD~3.3 1 %晚七刃e en di lfe rent lo ts of d ec trt 妇es.T lle op tinlal pH 、va 右 8.0.Their 即~lec t找xl e l比 g o x lse lec tivit y an drel革汾tab il ty即d can bel曰目 for ~15 tim es.It 15 sta ble for ov er hal fa ye习1 w hens to r曰 at 4℃.撇ty ~ ~口es ~ tes edd而caly 初th the ~ d ectrt 妇e an d E LI SA m et ll妇 fora 卫刀阵田姗.T he res ul ts d~tra tet ha t the ~it vi ty an ds详”俪ty of then, d 代切川eare 86.1 % 朋d 10 %, res p eC ti记y, su g g es t吨a pn 〕r u 匀n g p找料p 沈t forr司a pp licat ~.

聚间苯二胺膜乙肝免疫电极的研制

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/53964/%e8%81%9a%e9%97%b4%e8%8b%af%e4%ba%8c%e8%83%ba%e8%86%9c%e4%b9%99%e8%82%9d%e5%85%8d%e7%96%ab%e7%94%b5%e6%9e%81%e7%9a%84%e7%a0%94%e5%88%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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