戊型肝炎病毒衣壳蛋白重组抗原HEV 239能形成类病毒颗粒,具备演变成多价疫苗的载体的潜力,此文旨在筛选、鉴定其内包含的H-2d限制性Th表位。以50μg HEV 239蛋白与完全弗式佐剂混合后皮下免疫BALB/c鼠,以覆盖HEV 239蛋白全长的15氨基酸肽库体外刺激其脾细胞,用IFN--γELISPOT方法检测其细胞免疫应答,并通过磁珠剔除脾细胞中CD4+T细胞或CD8+T细胞以分析筛选得到的T细胞表位的特性。结果显示:HEV 239中包含优势的T细胞表位P34(HEV PORF2 AA533~AA547,HSKTF FVLPL RGKLS)及数个较弱的T细胞表位,P34对HEV 239免疫的BALB/c鼠脾细胞的刺激效果与HEV 239蛋白相当,剔除实验表明该表位为CD4+T细胞表位,即Th表位

伍小路

吴婷

夏宁邵

张军

李少伟

林春鑫

欧山海

程通

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戊型肝炎病毒颗粒性蛋白疫苗 H22d 限制性 Th 表位的筛选伍小路 ,吴婷 ,欧山海 ,林春鑫 ,程通 ,李少伟 ,张军 ,夏宁邵 3(厦门大学　国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 ,福建省医学分子病毒学研究中心 ,福建　厦门　361005)摘要 :戊型肝炎病毒衣壳蛋白重组抗原 HEV 239 能形成类病毒颗粒 ,具备演变成多价疫苗的载体的潜力 ,此文旨在筛选、鉴定其内包含的 H22d 限制性 Th 表位。以 50μg HEV 239 蛋白与完全弗式佐剂混合后皮下免疫 BALB/ c 鼠 ,以覆盖 HEV 239 蛋白全长的 15 氨基酸肽库体外刺激其脾细胞 ,用 IFN2γ2EL ISPO T 方法检测其细胞免疫应答 ,并通过磁珠剔除脾细胞中 CD4 + T 细胞或 CD8 + T 细胞以分析筛选得到的 T 细胞表位的特性。结果显示 : HEV 239中包含优势的 T 细胞表位 P34 ( HEV PORF2 AA533 ～ AA547 , HSKTF FVL PL RGKLS) 及数个较弱的 T 细胞表位 ,P34 对 HEV 239 免疫的 BALB / c 鼠脾细胞的刺激效果与 HEV 239 蛋白相当 ,剔除实验表明该表位为 CD4 + T细胞表位 ,即 Th 表位。关键词 :戊型肝炎病毒 ; T 辅助细胞 ; T 细胞表位中图分类号 :R392 　　文献标识码 :A 　　文章编号 :1000 - 8721 (2006) 03 - 0176 - 04收稿日期 :2005 - 12 - 01 ;修回日期 :2006 - 03 - 01基金项目 : 863 计划 ( 2005AA2Z3H20) ,福建省科技重大专项(2004 YZ01) ,厦门市重大产业科技项目 (3502Z20041008)作者简介 :伍小路 (1982 - ) 男 ,硕士 ,分子病毒学 , Tel : 86259222184110 ; E2mail : wuting @xmu1edu1cn通讯作者 :夏宁邵 , E2mail : nsxia @xmu1edu1cn　　戊型肝炎 (简称戊肝)是一种经肠道传播的急性肝炎 ,其病原体为戊型肝炎病毒 ( hepatitis E virus ,HEV) 。HEV 含 3 个开放读码框架 ( ORF) ,其中PORF2 编码含 660 个氨基酸的多肽 ,为病毒主要结构蛋白 ,组成病毒衣壳。本室以大肠杆菌表达戊型肝炎病毒 PORF2 第 368～606aa ( HEV 239) ,发现其能够形成类病毒颗粒 (VL P) ,作为疫苗不仅可以诱导良好的保护性抗体 ,而且能诱导出特异性细胞免疫应答[1 , 2 ] 。由于 VL P 疫苗通常易于被抗原呈递细胞(APC) 吞噬呈递 ,从而诱导较强的免疫应答。以VL P 蛋白做为肽表位疫苗的载体 ,可以明显提高表位肽的免疫原性 ,从而显现出广阔的应用前景[3 , 4 ] 。CD4 + T 辅助细胞 ( Th) 的功能与抗体产生密切相关[5 ] 。目前对于 HEV 239 蛋白的结构特征、免疫学特性、表位分布已积累了一些数据[6 ,7 ] ,在此基础上 ,进一步明确其 Th 表位对于开发该疫苗载体具有重要的意义。此文从覆盖 HEV 239 蛋白全长的15 氨基酸 (15aa)肽库中筛选到 HEV 239 蛋白的 H22d 限制性 Th 表位 ,为该疫苗的深入研究奠定了理论和实验基础。材料与方法1 　实验动物 　无特殊病原体 (SPF)级 BALB/ c 小鼠 ,雌性 ,6～8 周龄 ,由本校实验动物中心提供。2 　多肽的合成及肽库构建 　合成覆盖 HEV 239 蛋白全长的 15 氨基酸肽库 (西安美联公司 ,70 %纯度) ,相邻肽相互重叠 10 个氨基酸 ,共 46 条肽。各肽按照其顺序被命名为 P1～P46 ,以 DMSO 溶解多肽配置浓度为 10mg/ mL 的储存液 ,其中每 7 条肽混合在一起组成子肽库 ,共组成 14 个子肽库(表 1) 。表 1 　肽库的组成Table 1 　The construction of peptide librariesLibraries H I J K L M NA P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7B P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14C P15 P16 P17 P18 P19 P20 P21D P22 P23 P24 P25 P26 P27 P28E P29 P30 P31 P32 P33 P34 P35F P36 P37 P38 P39 P40 P41 P42G P43 P44 P45 P463 　疫苗及免疫 　将纯化的 HEV 239 蛋白 (北京万泰生物药业有限公司提供)与等体积完全弗氏佐剂 (CFA ,Sigma 公司)混合 ,制备成 015mg/ mL 浓度的疫苗 (2392CFA) ,以 100μl/鼠的剂量腹股沟以及颈部皮下免疫小鼠 ,两周后加强一次 ,加强后第 10d 取小鼠脾脏 ,分离脾细胞检测。以生理盐水与CFA 混合的疫苗 (NS2CFA)作为阴性对照疫苗。4 　小鼠脾脏细胞分离 　取免疫后小鼠脾脏 ,2ml 注射器研磨 ,200 目筛网过滤 ,5 %PBS (磷酸缓冲液) 洗涤后离心 ,3ml红细胞裂解液室温处理 3min ,加入 50ml PBS ,离心 , PBS 洗涤后将脾细胞重悬于 10 %1640 (含 10 %胎牛血清、1 %非必第 2 2 卷 　第 3 期2 0 0 6 年 5 月　　　　　　　　　　　病　　毒　　学　　报CHINESE JOURNAL OF VIROLO GY　　　　　　　　　　　Vol. 22 　　No. 3May 　　2 0 0 6需氨基酸、50μmol/ L β - 巯基乙醇、2mmol/ L 谷氨酰胺、1mmol/ L 丙酮酸钠、10 mmol/ L Hepes、100U/ mL 青霉素钠、100U/ ml 硫酸链霉素) ,细胞浓度调整为 1 ×107/ mL 。5 　IFN2γ2ELISPOT 检测 　按照试剂盒 (BDTM EL ISPO TSET) 说明书进行。简言之 : ( 1) 以抗 - 鼠 IFN - γ抗体100μl/ 孔 (5μg/ mL)包被 EL ISPO T 96 孔板。(2) 4 ℃孵育 12h后 ,各孔以含 10 % FBS的 1640 培养液室温封闭 2h ; (3)每孔接种小鼠脾细胞 1 ×106 个/ 200μL ,刺激抗原分别采用10μg/ mL HEV 239 蛋白 ,A～ G肽库 (其中每种肽的终浓度为 5μg/ mL) ,10μg/ mL 单独肽或 10μg/ mL BSA ,每个样品作3 个复孔。阳性或阴性对照孔则分别加入 2μg/ mL ConA 或单纯培养液。37 ℃静置培养 24 h ; (4) 各孔洗涤后加入生物素化抗鼠 IFN -γ抗体 ,100μl/ 孔 (215μg/ mL) ,室温反应 2h ;(5)各孔洗涤后加入链霉亲合素 - HRP ,100μl/ 孔 (5μg/ mL) ,室温反应 2h ; (6) 洗涤后加入 HRP 底物 AEC ,避光显色 ,以水冲洗终止晾干 ; ( 7 ) 以 ImmunoSpot ( Cellular TechnolgyLtd1公司) 进行计数和数据处理。以斑点数/ 106 脾细胞(Spots/ 106 spleen cells) 为单位 ,阴性孔 < 10 Spots/ 106 脾细胞 ,实验孔大于 2 倍阴性孔斑点数者为阳性。6 　剔除脾细胞中 CD4 + T细胞或 CD8 + T细胞以及流式细胞仪鉴定 　参照 Miltenyi 公司操作手册 ,取 107 新鲜分离的小鼠脾细胞 ,洗涤后重悬于 90μl staining buffer 中 ,加入 10μl与抗鼠 CD4 或抗鼠 CD8 抗体连接的磁珠 ,通过磁场分离 ,得到剔除 CD4 + T 细胞或 CD8 + T 细胞的小鼠脾细胞 ,重悬 ,计数 ,调整细胞浓度为 1 ×107/ mL 。取 106 细胞 ,重悬于100μl PBS ,加入 215μg / mL PE - Cy5 anti - mouse CD3e (BDPharmingen) 和 215μg / mL PE - anti - mouse CD8 ( BDPharmin - gen ) ,4 ℃孵育 15min , PBS 洗 2 遍 ,重悬于 1mlPBS ,以流式细胞仪 (Coulter Epics XL 购自 Beckman Coulter公司)检测相应的剔除效率。结　　果1 　HEV 239 的 H22d 限制性 T细胞表位的初步筛选用覆盖 HEV 239 蛋白全长的 15aa 肽库 (相邻肽段重叠 10aa) 做为 IFN2γ2EL ISPO T 实验中的刺激剂初步筛选 HEV 239 蛋白的 T 细胞表位。为简化筛选 ,将相邻的 7 条肽组成子肽库 A - N (表 1) ,分别刺激 2392CFA 及 NS2CFA 免疫后的 BALB/ c小鼠脾细胞。以 IFN2γ2EL ISPO T 检测其细胞免疫应答 ,结果表明 2392CFA 免疫鼠对肽库 E、M 反应强烈 ,每 106 个脾细胞中的斑点数超过 300 个 ;对肽库 A、B、F、H、I、K、N 有中等强度的反应 (50 ～ 150Spots/ 106 脾细胞) ;对肽库 C、D、G、J 、L 几乎无反应( < 20 Spots / 106 脾细胞) (图 1) 。肽库 E、M 中共 有的肽为 P34 ( PORF2 aa533 ～ 547 , HSKTFFVL PL R GKL S) ,推测该肽可能包含 HEV 239 蛋白的优势 H22d 限制性 T 细胞表位 ,而肽库 C、D、G、J 、L 包含的 26 个肽中不含有明显的 HEV 239 的 H22d 限制性 T 细胞表位 ,故将该 26 条肽排除在进一步筛选的范围之外。图 1 　不同肽库刺激 HEV 239 免疫小鼠脾细胞的 IFN2γ2EL ISPOT分析Figure 1 　IFN2γ2EL ISPO T assay to determine the reactivity of HEV 239immunized mice spleen cells to different peptide libraries2 　用单独肽进一步筛选 HEV 239 的 H22d 限制性 T细胞表位将 P34 肽以及其余 19 条肽单独做为刺激原分别刺激免疫鼠脾细胞 ,进行 IFN2γ2EL ISPO T 检测。结果表明 ,P34 的刺激效果最好 (413 Spots/ 106 脾细胞) ,与完整 HEV 239 蛋白相当 ,为 HEV 239 的优势 H22d 限制性 T 细胞表位 ; P35 的刺激效果较好(7615 Spots/ 106 脾细胞) ; P6、P7、P42 亦能刺激产生弱反应 (图 2) 。3 　P34 表位的 CD4 +或 CD8 +特异性分析首先以流式细胞仪检测通过磁珠剔除 CD4 + 或CD8 + T 细胞的效果。以 CD3 +细胞 (约占活细胞总数的 30 %)设“门”,分析细胞剔除前后相应细胞所占 CD3 +细胞的百分比。图 3 显示剔除 CD4 + T 细·771·　3 期 　　　　　　　伍小路等 :戊型肝炎病毒颗粒性蛋白疫苗 H - 2d 限制性 Th 表位的筛选胞前 ,CD4 + T 细胞约占 CD3 + 细胞的 6512 % ,经磁珠剔除后 ,降至 115 % ; 剔除 CD8 + T 细胞前后 ,CD8 + T 细胞占 CD3 + 细胞的比例分别为 2718 %和011 %。CD4 + 及 CD8 + T 细胞的剔除率分别为9717 %和 9916 %。图 2 　不同肽段刺激 HEV 239 免疫小鼠脾细胞的 IFN2γ2EL ISPO T 分析Figure 2 　IFN2γ2EL ISPO T assay to determine the reactivity of HEV 239immunized mice spleen cells to single peptide图 3 　磁珠剔除鼠脾细胞中 CD4 + 或 CD8 + T细胞的效果Figure 3 　The effect of CD4 + or CD8 + T celldepletion by magnetic beads　　以 10μg/ mL P34 分别刺激免疫鼠的脾细胞(CD4 + CD8 + ) 、去除 CD4 + T 细胞的脾细胞 ( CD4 -CD8 + ) 以及去除 CD8 + T 细胞的脾细胞 ( CD4 +CD8 - ) ,进行 IFN2γ2EL ISPO T 检测。结果显示 ,当CD8 +细胞被剔除之后 ,脾细胞对 P34 的反应没有发生明显变化 ;而当 CD4 +细胞被剔除之后 ,脾细胞对 P34 的反应显著下降 ,说明 P34 表位为 CD4 + T细胞表位 ( Th 表位) (图 4) 。以 10μg/ mL P2 肽作为阴性对照 ,结果均显示为阴性。图 4 　磁珠去除 CD4 + 或 CD8 + 细胞后的鼠脾细胞对 P34 肽刺激的 EL ISPO T 分析Figure 4 　Depletion of CD4 + or CD8 + T cells to identifythe characteristics of P34 T epitope讨　　论蛋白的 Th 表位与抗体形成密切相关 ,因此筛选鉴定蛋白质的 Th 表位是疫苗研究的关键问题之一[9 ] 。BALB/ c 小鼠 ( H22d) 是疫苗研究、单克隆抗体研制中的常用动物模型 ,此研究中以覆盖 HEV239 蛋白全长的 15AA 肽库 ,筛选其中 H22d 限制型T 细胞表位。结果发现肽段 P34 能够在体外有效刺激 HEV 239 免疫的 BALB/ c 小鼠脾细胞分泌 IFN-γ,是优势 H22d 限制性 T 细胞表位 ,通过磁珠去除鼠脾细胞中 CD4 + 或 CD8 + T 细胞证实 ,该表位·871· 病 　　毒 　　学 　　报 　　　　　　　　　　　　　　　　22 卷 　为 Th 表位。在类病毒颗粒表面插入免疫原性差的外源短肽 ,能够有效地暴露外源多肽的抗原表位 ,并且通过颗粒性载体自身激活 T 辅助细胞而促进浆细胞的形成。目前已有的类病毒颗粒疫苗载体有 HBVCore 蛋白颗粒[3 ,4 ] ,流感病毒的 Virosome[10 ]等等 ,均能有效呈递外源短肽 ,有很好的应用前景。目前HEV 239 疫苗的Ⅰ、Ⅱ期临床研究 ,显示了优秀的安全性和免疫原性。该蛋白包含 HEV PORF2 的 368～606aa ,自发组装成 23nm 直径的类病毒颗粒[6 ] 。我们已发现 HEV 239 上对应于 PORF2 368～394aa 的区域与颗粒形成有关 ,597～602aa 的疏水区与二聚体形成和中和表位构象有关[6 ]。此研究表明 533～547aa为优势 H22d 限制性 T 细胞表位。避开这些关键位点 ,寻找合适的外源短肽插入位点 ,有可能将 HEV239 发展成为一个新的高效的颗粒疫苗载体。另外 ,P34 肽表位 ( HSKTF FVL PL R GKL S) 作为高效Th 表位 ,也可以作为一个有效的功能结构单位 ,与其它强 Th 表位、Tc 表位、B 细胞表位等组合在一起 ,在多种肽表位疫苗的研制中发挥作用。参考文献 :[ 1 ] Li S W , Zhang J , Li Y M , et al1 A bacterially expressed particulatehepatitis E vaccine : antigenicity , immunogenicity and efficacy forprimates[J ]1 Vaccine , 2005 , 23 (22) : 2893 - 29011[2 ] 吴婷 ,欧山海 ,程通 ,等 1 戊型肝炎病毒重组颗粒性蛋白疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答研究[J ]1 病毒学报 ,2005 ,21 (6) : 428- 4331[ 3 ] Billaud J N , Peterson D , Barr M , et al1 Combinatorial approach tohepadnavirus - like particle vaccine design [J ] 1 J Virol , 2005 , 79(21) : 13656 - 13666.[ 4 ] Yang H J , Chen M , Cheng T , et al1 Expression and immunoactivi2ty of chimeric particulate antigens of receptor binding site - coreantigen of hepatitis B virus[J ]1 World J Gastroenterol , 2005 , 11(4) : 492 - 4971[ 5 ] Zhang G , Wang X , Robbins P F , et al1 CD4 + T cell recognition ofMHC class Ⅱ- restricted epitopes from N Y - ESO - 1 presentedby a prevalent HLA DP4 allele : Association with N Y - ESO - 1 an2tibody production [J ] 1 Proc Natl Acad Sci USA , 2001 , 98 ( 7) :3964 - 39691[6 ] Li S W , Zhang J , He Z Q , et al1 Mutational analysis of essentialinteractions involved in the assembly of hepatitis E virus capsid[J ]1J Biol Chem , 2005 , 280 (5) : 3400 - 34061[ 7 ] Zhang J , Gu Y , Ge S X , et al1 Analysis of hepatitis E virus neu2tralization sites using monoclonal antibodies directed against a viruscapsid protein[J ]1 Vaccine , 2005 , 23 (22) : 2881 - 28921[8 ] 何志强 ,张军 ,李少伟 ,等 1 颗粒化重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白及其抗原性与免疫原性[J ]1 生物工程学报 ,2004 ,20 (2) : 262 -2681[ 9 ] Shirai M , Arichi T , Chen M , et al1 T cell recognition of hypervari2able region - 1 from hepatitis C virus envelope protein with multipleclass ⅡMHC molecules in mice and humans : preferential help forinduction of antibodies to the hypervariable region[J ]1 J Immunol ,1999 , 162 (1) : 568 - 5761[ 10 ] Gluck R , Burri K G , Metcalfe I , et al1 Adjuvant and antigen de2livery properties of virosomes[J ]1 Curr Drug Deliv , 2005 , 2 (4) :395 - 4001Identif ication of H22d Restricted Th Epitope in Hepatitis E Virus ParticulateVaccine HEV 239WU Xiao2lu , WU Ting , OU Shan2hai , L IN Chun2xin , CHEN G Tong ,L I Shao2wei , ZHAN G J un , XIA Ning2shao( National Instit ute of Diagnostics and V accine Development in Inf ectious Diseases , Xiamen U niversity , Xiamen 361005 , China)Abstract :Recombinant particulate hepatitis E virus ( HEV) vaccine HEV 239 is a potential candidate of poly2va2lent vaccine vector1 In this paper , a dominant H22d rest ricted Th epitope in HEV 239 was identified1 Groups ofBALB/ c mice were subcutaneously (s1c1) immunized twice by 50μg HEV 239 protein mixed with complete Fre2und’s adjuvant (2392CFA) 1 A peptide library covering the whole HEV 239 protein , containing 46 peptides with10 amino acids overlapping , was synthesized and used to stimulate the spleen cells separated from the immunizedmice in vit ro1 IFN2γ2EL ISPO T assay results showed that P34 ( HEV PORF2 533 - 547aa , HSKTF FVL PLR GKL S) could stimulate the spleen cells to produce 413 spots/ million spleen cells which was similar to HEV 239protein1 Thus , the peptide P34 was identified as a dominant H22d rest ricted T cell epitope1 After depletion ofthe CD4 + T cells in the immunized spleen cells by magnetic bead separation , the IFN2γspots/ million spleen cellsdecreased to the background level while almost no influence was observed after CD8 + T cell depletion1 This re2sult showed that P34 was a H22d rest ricted Th epitope1Key words :hepatitis E virus ; Th cell ; T cell epitopeCorresponding author : XIA Ning2shao , E2mail : nsxia @ x m u1 edu1 cn·971·　3 期 　　　　　　　伍小路等 :戊型肝炎病毒颗粒性蛋白疫苗 H - 2d 限制性 Th 表位的筛选

戊型肝炎病毒颗粒性蛋白疫苗H-2~d限制性Th表位的筛选

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/21164/%e6%88%8a%e5%9e%8b%e8%82%9d%e7%82%8e%e7%97%85%e6%af%92%e9%a2%97%e7%b2%92%e6%80%a7%e8%9b%8b%e7%99%bd%e7%96%ab%e8%8b%97H-2~d%e9%99%90%e5%88%b6%e6%80%a7Th%e8%a1%a8%e4%bd%8d%e7%9a%84%e7%ad%9b%e9%80%89.pdf?sequence=1&isAllowed=y

戊型肝炎病毒颗粒性蛋白疫苗H-2~d限制性Th表位的筛选

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