[目的]建立RT PCR扩增Keratin19mRNA的方法 ,评价其应用前景。[方法]采用Keratin19cDNA的套式引物建立巢式RT PCR扩增体系 ,以酶切分析及DNA点杂交法鉴定扩增产物的特异性 ,逆转录产物系列稀释法分析检测敏感性 ,并对51例临床胃周淋巴结样品作初步检测。[结果]该扩增体系具有较好的扩增特异性 ,检测敏感性达1pgRNA ,相当于从105 个淋巴细胞中检出1个胃癌细胞 ;对临床样品检测结果显示该法较病理检查法敏感性高。[结论]该扩增体系具有较好的特异性、敏感性和较高的可靠性。福建省卫生厅基金!(编号 :96075);福建省自然科学基金!(F00024)资

吴艳环(厦门市中山医院)

李力

苏金华

蔡克瑕

陈瑞川

陈路芸

Xiamen University Institutional Repository

216 浙江肿瘤 2000年第 6卷第 4期巢式 RT PCR扩增 Keration 19诊断胃癌淋巴结微转移方法及应用应用 RT PCR检测癌细胞淋巴结微转移具有敏感、特异的优点, 其原理是选择肿瘤组织特异表达而被转移组织不表达的基因, 利用 RT PCR扩增检测该基因的转录产物, 即可判断是否存在转移的癌细胞 [1, 2]。Keratin19是角蛋白基因之一, 在淋巴结和外周血细胞中不表达 [2] ; 有报道证实该基因在胃癌中表达率达 100%[ 3]。故本文采用套式引物建立巢式RT PCT扩增Keratin 19 mRNA的体系及方法,并对临床样品进行了初步检测。1 材料与方法1 1 试剂及样品试剂: AMV逆转录酶、Taq酶、DNase 、内切酶等为 Promega产品; pBR322/ Hae Marker、RNasin及有关的生化试剂等为华美生物工程公司上海分公司生产;其余均为国产分析纯。细胞株 : 人胃腺癌 MGC803 及人早幼白血病HL 60细胞株为本单位细胞生物学研究室保存; 常规方法培养。组织样品收集: 胃周淋巴结样品分别取自胃癌患者手术切除标本 ( 40例) 和非癌患者胃手术切除标本 ( 11例) ; 胃及胃癌活检样品取自行胃镜检查患者; 样品均作常规病理切片检查[4 ], 其中淋巴结样品镜检证实转移阳性者 32例,阴性者 19例。外周血取自健康人,常规方法分离白细胞。引物设计及合成: actin引物按报道[3], Keratin19的套式引物根据其 cDNA序列并参照文献报道[ 2]以 DNASIS软件系统设计,序列如下:AF: 5 TCATCACCATTGGCAATGAG 3 AR: 5 CACTGTGTTGGCGTACAGGT 3 KF1: 5 AGGTGGATTCCGCTCCGGGCA 3 KR1: 5 GAGGACCTTGGAGGCAGACA 3 KF2: 5 CTGCCTTGGAAGACACTG 3 ( 1 厦门大学生命科学院抗癌研究中心,福建 厦门 361005; 2 厦门大学生命科学院生物系,福建厦门 361005; 3 厦门市中山医院,福建厦门 361005)陈瑞川 1,苏金华 1,蔡克瑕 1,陈路芸 2,李 力 2,吴艳环 3Method of Detecting Gastric Cancer Micrometastases in Lymph Nodes by NestRT PCR Amplification of Keration 19 and its ApplicationCHEN Rui chuan, SU Jin hua, CAI Ke xia, et al.( Dept. of Biology, Life Science College of Xiamen Univesity, Xiamen 361005, China )摘 要: [目的 ]建立 RTPCR扩增 Keratin 19 mRNA的方法,评价其应用前景。[方法]采用 Keratin 19 cDNA的套式引物建立巢式RT PCR扩增体系, 以酶切分析及 DNA 点杂交法鉴定扩增产物的特异性, 逆转录产物系列稀释法分析检测敏感性, 并对 51例临床胃周淋巴结样品作初步检测。[结果]该扩增体系具有较好的扩增特异性,检测敏感性达 1pg RNA,相当于从 105个淋巴细胞中检出 1个胃癌细胞;对临床样品检测结果显示该法较病理检查法敏感性高。[结论]该扩增体系具有较好的特异性、敏感性和较高的可靠性。关键词:胃肿瘤;聚合酶链反应;角蛋白 19;淋巴转移;基因扩增;中图分类号: R735 2 文献标识码:A 文章编号: 1006- 5504( 2000) 04- 0216- 03收稿日期: 2000- 01- 31;修回日期: 2000- 07- 10本文由福建省卫生厅基金 (编号: 96075) 和福建省自然科学基金( F00024)资助Abstract: [ Purpose] To develop a RTPCR method to amplify Keratin 19 mRNA for detecting gastric cancer cells metastases in gastric lymphnodes and to evaluate its specificity and sensitivity. [ Methods] The RTPCR system was set up by using nest primer. Its amplificat ion products wasidentified by restriction enzyme digestion and DNA dot blot . The sensitivity was estimated with serial diluted reverse transcript templates. Moreover, 51lymph nodes were analyzed by this RTPCR method and pathological examination, respectively. [ Results ]This system possessed a good specificity, itsdetection sensitivity was 1pg RNA from 100ng control RNA which means detecting out one gastric cancer cell from 105lymph cells. The resultsperformed on clinical gastric lymph nodes showed that the sensitivity of RTPCR was superior to pathological examination. The dot hybridization testfurther proved the high specifici ty of RT PCR.!Conclusion∀ The amplification system presents good reliability, high sensitivity and specificity.Key words:stomach neoplasms ; polymerase chain reaction; Keratin 19; lymphatic metastasis ; gene amplification217浙江肿瘤 2000年第 6卷第 4期图 2 RTPCR的检测敏感性分析Ma: pGEM3Zf( + ) / Hae ; MGC803 RNA量为 1: 100ng、2: 10ng、3: 1ng、4: 100pg、5: 10pg、6: 1pg、7: 100fgKR2: 5 ATCTTCCTGTCCCTCGAGCAG 3 AF加 AR的扩增产物长为 154bp。KF1加 KR1的扩增产物为 494bp的片段, 以此扩增产物为模板再用 KF2加 KR2扩增的产物长为 215bp。引物均由上海生工公司合成。1 2 总 RNA提取按 Chomczynski一步法[5 ]提取总 RNA并以甲醛凝胶电泳鉴定完整性。1 3 逆转录参照文献方法[6 ]并作修改如下: 在 20 l的逆转录体系中, 含经热变性处理的 RNA 2 g、1mmol/ LdNTPs、20 U RNasin、10U AMV逆转录酶及100pmol六核苷酸随机引物, 37# 逆转录 60min, 95 # 灭活10min。1 4 PCR及巢式 PCR扩增actin扩增及 Keratin19的第一轮扩增: 50 l的体系含缓冲液、1 l~ 5 l逆转录产物、2 0mmol/ LMgCl2、100 mol/ L dNTPs、25pmol的上下游引物( AF+AR或 KF1+ KR1) 2 5U Taq酶, 95 # 变性 5min后进入 PCR循环, 循环参数为 94 # 1min、60# 1min、72#1min, 40个循环, 72 # 补齐 5min。Keratin 19的第二轮扩增体系为: 50 l 体积含 5 l第一轮扩增产物、1000 mol/ L dNTPS、25pmol上下游引物( KF2+ KR2) ,其余成份及循环参数均同上。扩增产物以 2%琼脂糖电泳、EB染色、紫外观察及拍照。1 5 PCR产物的酶切鉴定根据扩增产物的序列, 选择 Hinf 酶切消化actin的扩增产物; Xho 及 Hinf 分别酶切 Keratin 19的扩增产物, 酶切后以 12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳、EB染色、紫外观察及拍照分析。1 6 PCR产物的点杂交验证取 RT PCR的扩增产物 5 l碱变性后于 12 ∃ 8孔的点膜器上点于硝酸纤维膜, 80# 烤 2h。另取上述经酶切鉴定并经低熔点琼脂糖电泳纯化的 PCR产物为模板, 参照 DIG DNA标记检测试剂盒说明及前文报道[ 7]进行探针标记及杂交检测。2 结 果2 1 RT PCR的扩增特异性由 DNASIS 软件系统分析表明 : Keratin 19的PCR 产物经 Hinf 或 Xho 酶切后可分别产生125bp及 90bp或 198bp及 17bp的片段; 而 actin的PCR扩增产物经 Hinf 酶切后可产生 86bp及 68bp的片段。图 1所示为 Keratin 19及 actin的 PCR扩增产物经 Hinf 或 Xho 酶切后的 PAGE EB分析结果。显示酶切后产生的片段大小与序列分析结果一致, 表明所建立的 RT PCR体系具有较好的扩增特异性。2 2 RT PCR的检测敏感性将来自 MGC803的逆转录产物 ( cDNA) 按 10倍稀释后各取 1 l(相当于 100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg 及 100fg的 RNA) , 再各加入来自 HL 60逆转录产物 1 l(相当于 100ng的 RNA)混合为模板,分别以 Keratin19 的套式引物及 actin 的引物进行PCR扩增, 扩增后将 Keratin19及 actin管中的 PCR产物混匀上样, 电泳分析, 结果见图 2。显示检测敏感性达1pg的 RNA,该敏感性相当于从105个白细胞或淋巴细胞中检测出 1个胃癌细胞。2 3 临床样品的 RTPCR分析结果以 RT PCR对经病理检查过的 51例胃周淋巴结样品进行检测: 32例病理检查转移阳性及 11例非胃癌患者 (转移阴性) 样品的 RT PCR检测结果显示与病理检查结果一致, 但在另 8例病理检查阴性的来自胃癌患者的胃周淋巴结样品中, RT PCR检测阳图 1 Keratin 19及 actin RT PCR扩增产物的酶切分析结果Ma: pGEM 3Zf( + ) / Hae ; 1, 4: MGC803; 2, 5: 胃粘膜活检标本; 6:外周血白细胞; 7: 正常淋巴结; 8: HL60;3: Keratin 19; 9: actin218 浙江肿瘤 2000年第 6卷第 4期性者 5例 (见图 3) , 表明 RT PCR检测敏感性较病理检查法高(见表 1)。2 4 PCR产物的点杂交验证以上述 RT PCR产物点膜, 分别以 actin及Keratin 19的 DIG标记探针进行杂交检测, 结果显示: 以 actin探针杂交检测所有产物均阳性, 而Keratin 19探针检测显示 RT PCR检测阳性的胃癌胃周淋巴结样品 ( 37例) 均有杂交信号, 检测阴性的( 14例) 则杂交阴性, 表明 Keratin 19作为 RT PCR检测胃癌淋巴结微转移标志基因有较好的可靠性。3 讨 论目前胃癌淋巴结转移的临床检测主要靠病理检查, 敏感性较差, 一些微小转移灶常被漏检, RT PCR技术因其具有较高的敏感性和特异性而被应用于癌微转移的检测[1 ]。RT PCR技术的应用依赖于特异标志基因; Keratin 19在胃癌的表达率为 100%[ 3], 因此该基因也可作为检测胃癌淋巴结转移的标志基因。本文以套式引物建立了巢式 RT PCR扩增检测 Keratin 19 mRNA的方法, 其敏感性达 1pg RNA, 即可从105个淋巴或白细胞中检出 1个胃癌细胞, 较 Mori[8 ]及 Noguchi[ 2]报道的敏感性高, 也较病理探查结果更敏感 (见图 3及表 1)。为减化 PCR过程, 我们曾按Noguchi报道的引物对 ( KF1+ KR2)以常规 PCR方法进行扩增,但未能获得较好的特异性,可能与所用的PCR试剂成份不同有关。巢式RT PCR虽然增加了一步 PCR, 但对于提高扩增的特异性及敏感性均有助益。RT PCR检测的敏感性已被公认, 但也常出现非特异扩增[9]; 由于目前尚无较 RT PCR更敏感的方法来对 RT PCR临床检测结果的特异性进行验证[10 ],本文尝试以酶切分析法及 DNA点杂交法对扩增产物进行分析, 其根据在于若能证实扩增产物的特异性即可确定 RT PCR检测结果的可靠性[9]; 同时对临床样品也作了选择, 特选了取自非胃癌患者手术标本 (不存在胃癌转移) 淋巴结来进行 RT PCR检测,较全面地考察了本法的特异性, 显示 Keratin19作为RT PCR法检测胃癌淋巴结转移的标志基因具有较高的可靠性及应用价值。对临床样品的检测结果也说明了该 RT PCR扩增体系具有较好的可靠性。当然, 该扩增体系还需更多的临床验证。参考文献:江继发, 魏海明 检测肿瘤转移指标的临床意义 [ J]国外医学肿瘤学分册, 1998, 25: 224- 226.Noguchi S, Hiratsuka M, Furukawa H, et al. Detection of gastric cancer micrometastases in axillary lymph nodes by amplification of Keratin 19 mRNA with reverse transcriptasepolymerase chain reaction [ J] . Jpn J Cancer Res, 1996,87: 650- 654.Moll R, Franke WW, Colombero A. The catalog of human cytokeratins: patterns of expression in normal epithelia, tumorsand cultured cells [ J] . Cell, 1982, 31: 11- 24.Chen RC, Zhang CG, Wu YH, et al. Diagnosis of Helicobacterpylori infection : a qualitative method and its application[ J] . World Chinese J Digestion, 1998, 6: 192- 194.Chomczynski P, Sacchi N. Single- step method of RNA isolation by acid guanidnium thiocyanate phenol chloroform extraction [ J] . Anal Biochem, 1987, 162: 156- 159.荆永娜, 卢大儒,邱信芳,等 影响反转录过程多种因素的探讨[ J] 细胞生物学杂志, 1998, 20: 38- 41陈瑞川, 杨善民, 张铮, 等 视黄酸对 BEL7402细胞酶活性及基因表达的影响 [ J] 厦门大学学报, 1998, 37:259- 264Mori M, Mimori K, Inoue H, et al. Detection of cancer micrometastases in lymph nodes by reverse transcriptasepolymerase chain reaction [ J] . Cancer Res, 1995, 55:3417- 3420.林万明 PCR技术操作和应用指南 [ M] 北京: 人民军医出版社, 1993, 30- 50张琴 肿瘤微转移检测的进展 [ J] 国外医学肿瘤学分册, 1996, 23: 224- 226[ 1][ 2][ 3][ 4][ 5][ 6][ 7][ 8][ 9][ 10]图 3 部分胃淋巴结样品 RTPCR检测结果Ma: pCEM3Zf( + ) /Hae marker;1, 2:病理检查阳性胃癌胃周淋巴结样品3~ 7:病理检查阴性胃癌胃周淋巴结样品8~ 10:病理检查阴性胃癌胃周淋巴结样品10, 11:非胃癌胃周淋巴结样品

Method of Detecting Gastric Cancer Micrometastases in Lymph Nodes by Nest RT-PCR Amplification of Keration 19 and its Application

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