为确定全反式视黄酸 ( ATRA)抑制胃癌细胞 AP- 1活性过程中 RARα介导的作用机理 ,利用 Northern印迹和 Western印迹测定 RARα基因和 c Jun、c Fos蛋白表达水平 ;氯霉素乙酰转移酶活性 ( CAT)分析 AP- 1活性 ;以及 MTT法检测细胞生长速率 .结果表明 ,ATRA能够诱导 RARα表达 ,抑制 c Jun和 c Fos蛋白表达和 AP- 1活性 ,由此导致胃癌细胞生长抑制 .结果证实 ,ATRA抑制胃癌细胞 AP- 1活性是抑制细胞生长的重要途径之一 ,并与 RARα介导密切相关 . 
【英文摘要】 To determine the mechanism of RARα involvement when AP 1 activity was inhibited by all\| trans retinoic acid (ATRA) in gastric cancer cells,expressions of RARα gene and cJun and cFos protein were detected by Northern blot and Western blot.AP 1 activity was measured by CAT assay,and the inhibitory rate was analyzed by MTT method.The results showed that expression of RARα was induced after treatment of gastric cancer cells with ATRA,ATRA inhibited expression of cJun and cFos,as well as AP 1 activity,whi...国家自然科学基金(39880015)；国家杰出青年科学基金(B 类，39825502)资

吴乔

苏文金

陈正明

Xiamen University Institutional Repository

ISSN 　100727626CN 　1123870öQ中国生物化学与分子生物学报Ch in. J. B iochem. M o l. B io l. 2000, V o l. 16, N o. 5, 684～ 688第16卷第5期2000年　10月　3 　国家自然科学基金 (39880015)和国家杰出青年科学基金(B 类) (39825502)资助　　　联系人: 吴乔, 女, 1959年5月生, 博士, 副研究员T el: (0592) 2182542, Fax: (0592) 2086630E2m ail: XGWU @XM U. EDU. DN收稿日期: 1999211224, 修回日期: 2000202216胃癌细胞中 AP-1活性与 RARΑ介导的相关性3吴　乔　陈正明　苏文金(厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室, 厦门　361005)摘要　为确定全反式视黄酸 (A TRA ) 抑制胃癌细胞A P21活性过程中 RA R Α介导的作用机理, 利用N o rthern 印迹和W estern 印迹测定RA R Α基因和 cJun、cFo s 蛋白表达水平; 氯霉素乙酰转移酶活性 (CA T )分析A P21活性; 以及M T T 法检测细胞生长速率Λ结果表明, A TRA 能够诱导 RA R Α表达, 抑制 cJun 和 cFo s 蛋白表达和A P21活性, 由此导致胃癌细胞生长抑制Λ结果证实,A TRA 抑制胃癌细胞A P21活性是抑制细胞生长的重要途径之一, 并与RA R Α介导密切相关Λ关键词　A P21活性, RA R Α, cJunöcFo s, 全反式视黄酸, 胃癌细胞中图分类号　Q 753, Q 228Rela tion sh ip Between AP-1 Activ ity and RARΑ Involvem en tin Gastr ic Cancer Cells3W U Q iao, CH EN Zheng2m ing, SU W en2jin(T he K ey L abora tory of M in istry of E d uca tion f or Cell B iology and T um or Cell E ng ineering ,X iam en U niversity , X iam en　361005, Ch ina)Abstract　To determ ine the m echan ism of RA R Α invo lvem en t w hen A P21 act ivity w as inh ib itedby all2trans ret ino ic acid (A TRA ) in gastric cancer cells, exp ression s of RA R Αgene and cJun andcFo s p ro tein w ere detected by N o rthern b lo t and W estern b lo t. A P21 act ivity w as m easu red byCA T assay, and the inh ib ito ry ra te w as analyzed by M T T m ethod. T he resu lts show ed thatexp ression of RA R Αw as induced after t rea tm en t of gastric cancer cells w ith A TRA , A TRAinh ib ited exp ression of cJun and cFo s, as w ell as A P21 act ivity, w h ich led to grow th inh ib it ion ofgastric cancer cells. T he data indica te that inh ib it ion of A P21 act ivity by A TRA is one ofimpo rtan t pathw ay to inh ib it grow th of gastric cancer cells, and RA R Α invo lves in A TRA act ion.Key words　A P21 act ivity, RA R Α, cJunöcFo s,A ll2trans ret ino ic acid, Gastric cancer cell　　A P21 (act iva to r p ro tein21) 是一种转录因子, 其主要组成成分是癌蛋白 cJun 和 cFo s[1 ] , 它们形成同源二聚体 (cJunöcJun) 或异源二聚体 (cJunöcFo s) 而结合到含有A P21位点的DNA 序列上 (如 T PA 应答元件, 胶原酶启动子) , 由此激活A P21的转录活性[2 ]Λ 一 些 促 有 丝 分 裂 剂, 如 T PA ( 122O 2tet radecanoylpho rbo l2132aceta te )、表皮生长因子( EGF ) 和胰岛素样生长因子 ( IGF ) 通过激活A P21刺激细胞生长、导致细胞转化Λ另一些激素, 如甲状腺激素、雌性激素、糖皮质激素以及视黄酸通过抑制A P21而阻止 T PA、EGF 和 IGF 的作用, 这对于调节细胞生长和分化具有重要意义Λ视黄酸 ( ret ino ic acid, RA ) 作用主要由其受体RA R s (ret ino ic acid recep to rs) 和 RXR s ( ret ino id Xrecep to rs)介导[3 ]Λ这些受体属于类固醇ö甲状腺激素受体超家族成员, 由3种不同基因 Α、Β和 Χ编码,形成不同的受体亚类, 发挥不同的功能ΛRA R s 通过与A P21蛋白之间的相互作用抑制其结合到特异的DNA 序列上Λ近来的研究还表明, CBP (cAM Prespon se elem en t2b inding p ro tein) 作为共同激活因子参与A P21活性的抑制过程[4 ]Λ然而, 它们之间的交叉通讯 (cro ss2ta lk)机制至今仍未阐明Λ胃癌是中国的主要癌症之一Λ我们已报道RA可以通过诱导细胞分化和调节细胞周期等途径抑制胃癌细胞生长, 并可能与A RA Α和RA R Β的诱导相关[5 ]ΛRA 与胃癌细胞A P21活性的相关性未见报道, 本文探讨 RA 抑制 A P21活性的可能性, 以及RA R Α介导的分子机理Λ结果证实RA 抑制A P21活性可能是其抑制胃癌细胞生长的重要途径之一Λ1　材料和方法111　细胞培养和药物处理四株胃癌细胞均用R PM I21640培养液培养Λ细胞接种24 h 后加入全反式视黄酸 (a ll2t ran s ret ino icacid, A TRA , Sigm a) 处理ΛM GC8023细胞由厦门大学抗癌中心提供, BGC2823、SGC27901和M KN 245细胞购于上海细胞所细胞库Λ112　报告基因质粒和各种表达质粒报告基因 ( - 73Co l2CA T ) 是 CA T ( ch lo ramphen ico l acetylt ran sferase ) 基因连接的胶原 酶(co llagenase) 启动子, 其上存在一个A P21结合位点, 位于- 63和- 73残基之间Λ此报告基因通常被用以测定A P21活性[1 ]ΛRA R Α、cJun 和 cFo s 表达质粒的构建参见文献[ 1 ]Λ113　D NA 瞬时转染和CAT 活性测定将报告基因、相关表达质粒 (如RA R Α、或 cJun和 cFo s 等) 和 Β2半乳糖苷酶表达质粒 (Pharm acia)等通过脂质体介导法 (根据 GibcoöBR I 操作程序)瞬时转染到细胞中, 转染后分别加入 T PA (100 ΛgöL ) 或ö和A TRA (1 Λmo löL ) 处理细胞24 h, 再测定Β2半乳糖苷酶活性和CA T 活性[6 ]Λ114　RNA 提取和 Northern 印迹硫氰酸胍2氯化铯离心法提取总RNA Λ以 Α232P2dA T P 和 Α232 P2dCT P (北京亚辉生物公司) 标记DNA 探 针, 按常规方法进行N o rthern 印迹[6 ]Λ115　蛋白裂解液制备和W estern 印迹常规方法制备细胞裂解液[5 ] , SD S2PA GE, 蛋白转膜后与相应抗体 (San ta C ruz) 温育, ECL 试剂盒(Am ersham )显示蛋白Λ116　基因转染和稳定表达脂质体介导法将反义 RA R Α转染到BGC2823细胞, G418 筛选细胞, N o rthern 印迹方法确定RA R Α基因在细胞中的表达Λ117　细胞生长速率测定 (M TT 法)10- 6 mo löL A TRA 连续处理细胞9 d,M T T (32[ 4, 52dim ethylth iazo l222y1 ]22, 52diphenyltet razo lium b rom ide, Sigm a 产品)染色细胞, 酶标仪上测定细胞反应液的A 570值, 计算细胞生长相对速率[5 ]Λ2　结　　果211　ATRA 对胃癌细胞AP-1活性的抑制我们的研究已表明, 在10- 6 mo löL A TRA 作用下, 胃癌细胞M GC8023、BGC2823和 SGC27901的生长抑制率分别为53120%、61103% 和33150% , 但是,A TRA 不能抑制M KN 245细胞生长, 抑制率仅为3187% [10 ]Λ为了确定A TRA 对胃癌细胞A P21活性抑制的可能性, 我们将报告基因瞬时转染细胞ΛCA T 测定表明, 在 M GC8023、BGC2823 和 SGC27901细胞中, A TRA 可以抑制 T PA 诱导的CA T 活性, 抑制作用随 A TRA 浓度增加而加强, 而在M KN 245细胞中, A TRA 不能抑制 T PA 诱导的CA T 活性 (F ig. 1) Λ结果与A TRA 对胃癌细胞生长抑制的结果吻合, 提示A TRA 抑制A P21活性可能与其抑制胃癌细胞生长密切相关Λ212　RARΑ介导ATRA 抗AP-1活性的作用A TRA 作用主要由其受体 RA R s 和 RXR s 介导, 为了确定受体介导的作用, 我们首先检测RA R Α、RA R Β 和 RXR Α 在细胞中的表达水平ΛN o rthern 印迹分析表明,A TRA 能够诱导M GC8023、BGC2823和 SGC27901细胞RA R Α的表达, 不能诱导M KN 245细胞 RA R Α的表达Λ但是A TRA 不能诱导四株细胞RA R Β和 RXR Α的表达, 尽管 RA R Β在M KN 245细胞不表达 (F ig. 2) Λ以上结果提示,A TRA 对RA R Α诱导可能与其抑制A P21活性有关Λ为了证实这一可能性, 我们将反义 RA R Α和正义 RA R Α分别转染 BGC2823和M KN 245细胞并稳定表达Λ与各自对照组对比,BGCöaRA R Α26的 RA R Α表达被抑制, A TRA 不能诱导其表达; 但M KN öRA R Α24的RA R Α表达增强,且A TRA 诱导RA R Α表达 (F ig. 3) Λ当报告基因瞬时转染细胞后, A TRA 抑制BGC2823细胞的A P21活性, 但不能抑制 BGCöaRA R Α26细胞的 A P21活性; 相反, 不能抑制M KN 245细胞的A P21活性, 而抑制M KN öRA R Α24细胞的A P21活性 (F ig. 4) ΛM T T测定证实, A TRA 抑制BGC2823细胞生长, 但不能抑制BGCöaRA R Α26细胞生长, 抑制率从61103% 下降为1814% ; 相反, A TRA 不能抑制M KN 245细胞生长, 而抑制M KN öRA R Α24细胞生长, 抑制率从3187% 上升到3117% Λ结果不仅表明 RA R Α的介导作用, 而且证实A TRA 通过抑制A P21活性而抑制胃癌细胞生长Λ586第5期 吴　乔等: 胃癌细胞中A P21活性与RA R Α介导的相关性 　F ig. 1　 Inh ib ito ry effect of A TRA on A P21 activity in four gastric cancer cell lines(A )M GC8023; (B)BGC2823; (C) SGC27901; (D )M KN 245F ig. 2　Exp ression of RA RΑ, RA RΒ and RXRΑmRNA infour gastric cancer cell lines213　ATRA 对 cJun 和 cFos 表达的调节A P21的主要成分是 cJun 和 cFo s 蛋白ΛA TRA抑制胃癌细胞A P21活性的结果提示, A TRA 可能调节 cJun 和 cFo s 水平ΛW estern 印迹分析表明,A TRA 抑制M GC8023、BGC2823和 SGC27901细胞的 cJun 表达, 但不能抑制M KN 245细胞的 cJun 表达ΛcFo s 在M KN 245细胞中不表达, A TRA 抑制M GC8023、BGC2823 和 SGC27901 细胞 cFo s 表达(F ig. 5) Λ214　ATRA 对 HeLa 细胞的作用宫颈癌 H eL a 细胞不表达内源性 RA R s 和RXR s[1 ] , 因而我们利用它作为参照 , 进一步证实F ig. 3　Exp ression of RA RΑmRNA in BGCöaRA RΑ26 and M KN öRA RΑ24 cell lines686 中国生物化学与分子生物学报 16卷A P21活性与RA R Α的相关性ΛCA T 测定显示, 当外源性RA R Α表达质粒不存在时,A TRA 只能轻微地抑制 T PA 诱导的CA T 活性 (抑制率约11% ) , 而当外源性RA R Α表达质粒转染细胞时,A TRA 则显著抑制 T PA 诱导的CA T 活性 (抑制率约62% ) (F ig.6) Λ表明A TRA 可以通过RA R Α介导而加强对A P21活性的抑制Λ进一步观察 cJunöcFo s、RA R Α与A P21活性之间的相关性ΛCA T 测定显示, 当外源性RA R Α表达质粒不存在时,A TRA 只能轻微地抑制 cJunöcFo sF ig. 4　Effect of A TRA on A P21 activity in BGCöaRA RΑ26and M KN öRA RΑ24 cell linesF ig. 5　Exp ression of cJun and cFo s (B)p ro tein in four gastric cancer cell lines(A ) cJun; (B) cFo s; (C) Po sit ive con tro l诱导的 CA T 活性 (抑制率约20% ) , 而当外源性RA R Α表达质粒转染细胞时, A TRA 则显著抑制cJunöcFo s 诱导的CA T 活性 (抑制率约58% ) (F ig.7) Λ结果证实, A TRA 对A P21活性的抑制与RA R Α介导的对 cJun、cFo s 的抑制密切相关ΛF ig. 6　Effect of RA RΑon A P21 activity in H eL a cellsF ig. 7　Effect of cJunöcFo s and RA RΑon A P21 activity inH eL a cells3　讨　　论视黄酸作用主要由其受体 RA R 和 RXR 介导[3 ] , 视黄酸及其受体对A P21活性的抑制已被认为是其抑制细胞生长和转化的重要机制之一[7 ]Λ在乳腺癌细胞中, RA R Α或 RXR Α介导 R EM ( ret inyl786第5期 吴　乔等: 胃癌细胞中A P21活性与RA R Α介导的相关性 　m ethyl ether) 的抗A P21活性[8, 9 ] , 而在 RA 抗性的卵巢癌细胞中, RA R s 和 RXR Α的过度表达可以恢复视黄酸对A P21活性和细胞生长的抑制[10 ]Λ本文结果也表明, 视黄酸抑制A P21活性与其抑制胃癌细胞生长密切相关ΛA TRA 抑制M GC8023、BGC2823和 SGC27901细胞生长和 A P21活性, 但不能抑制M KN 245细胞生长和A P21活性, 而且对A P21活性的抑制是由 RA R Α介导的, 当反义 RA R Α转染BGC2823细胞时, 由于RA R Α表达受到抑制,A TRA则不能抑制A P21活性, 由此导致A TRA 对胃癌细胞生长抑制作用的丧失Λ反之, 当正义RA R Α转染M KN 245细胞时, 由于A TRA 诱导 RA R Α表达, 因此能够抑制A P21活性和细胞生长Λ进一步实验则证实, 当外源性RA R Α瞬时转染H eL a 细胞时, A TRA可以显著抑制A P21活性, 抑制率提高近6倍Λ这些结果证实,A TRA 诱导的内源性RA R Α能够介导其对A P21活性的抑制, 并通过它而有效地抑制胃癌细胞生长ΛA P21主要组成成分为 cJun 和 cFo s 蛋白[1 ]Λ已知A P21活性可由多种途径调节, 包括 cJun 和 cFo s蛋白表达及其磷酸化、cJun 正向自主调节和 cFo s反向自主调节, 其中 cJun 和 cFo s 蛋白水平的变化则 是 最 直 接 的 调 节 方 式Λ因 此, A TRA 抑 制M GC8023、BGC2823 和 SGC27901 细胞的 cJun 和cFo s 表达与其抑制A P21活性直接相关, 而不能抑制M KN 245细胞的 cJun 表达则导致其不能抑制A P21活性Λ而当RA R Α介导时, A TRA 就有效地抑制 cJunöcFo s 诱导的A P21活性, 这是由于在 cJun和RA R Α之间存在一种蛋白2蛋白的直接作用, 从而阻滞 cJun 结合到其应答元件上[1, 4 ]Λ有关报道还指出, RA R Α阻止 cJun 和 cFo s 形成二聚体, 抑制A P21活性[1 ] , RA R Α还可以直接抑制一种与 cJun 作用的促进DNA 结合的细胞因子而导致A P21活性下降[4, 8 ]Λ值得注意的是, 在 M KN 245细胞中, 尽管RA R Α表达, 却不能介导A TRA 抗A P21活性, 我们认为这是由于 RA R Α表达水平过低的缘故, 因此,A TRA 对RA R Α水平的诱导具有关键作用Λ致谢　报告基因、RA R Α、cJun 和 cFo s 等表达质粒由张晓坤博士 (美国加州Burnham 研究所)惠赠, 在此致谢Λ参考文献 (References)1 　 Yang2Yen H F, Zhang X K, Graupner G, T zukerm an M ,Sakamo to B , Karin M , Pfah l M. A ntagon ism betw een retino icacid recep to rs and A P21: imp lications fo r tumo r p romo tion andinflam ation. N ew B iol, 1991, 3: 1206～ 12192 　A ngel P, Karin M. T he ro le of Jun, Fo s, and the A P21 comp lexin cell p ro liferation and transfo rm ation. B ioch im B iop hy s A cta,1991, 1072: 129～ 1573 　Zhang X K, Hoffm ann B, T ran P, Graupner G, Pfah lM. Retino idX recep to r is an aux iliary p ro tein fo r thyro id ho rmone andretino ic acid recep to rs. N atu re (L ondon) , 1992, 355: 441～ 4464 　Ro land S, Pundi R , Yang N , Steven K, L ynn J R , Jack B, InderM V , Ronald M e. Retino ic acid is a negative regu lato r of A P212responsive genes, P roc N a tl A cad S ci U SA , 1991, 88: 6092～60965 　陈正明, 吴乔, 陈玉强, 苏文金1视黄酸对胃癌细胞周期的调控,实验生物学报 (Chen Zheng2m ing,W u Q iao, Chen Yu2qiang, SuW en2jin. Regu lation of cell cycle by retino ic acid in gastriccancer cells. A cta B iol E xp S in) , 1999, 32 (2) : 135～ 1406 　吴乔, 张晓坤1孤生受体的相互作用对视黄酸应答元件的影响1中国生物化学与分子生物学报 (W u Q iao, Zhang X iao2kun.In teraction of o rphan recep to rs and their effect on retino ic acidrecep to r elem en ts. Ch in J B iochem M ol B iol) , 1999, 15 (1) : 136～ 1417 　W an H , D aw son M I, Hong W K, L o tan R. Enhancem ent ofCalu21 hum an lung carcinom a cell grow th in serum 2freem edium by retino ids: dependence on A P21 activation, bu t no t onretino id response elem en t activation. O ncog ene, 1997, 15: 2 109～ 2 1188 　van der Burg B , Slager2D uvidov R , van der L eede B M , de L aatS W , van der Saag P T. D ifferen tial regu lation of A P1 activityby retino ic acid in ho rmone2dependen t and 2independen t b reastcancer cells. M ol Cell E nd oc, 1995, 112: 143～ 1529 　Chen T K, Sm ith L M , Gebhardt D K, B irrer M J , B row n P H.A ctivation and inh ib it ion of the A P1 comp lex in hum an breastcancer cells. M ol Carcinog , 1996, 15: 215～ 22610　Sop rano D R , Chen L X,W u S J , Don igan A M , Bo rghaci R C,Sop rano K J. O verexp ression of bo th RA R and RXR resto resA P21 rep ression in ovarian adenocarcinom a cells resistan t toretino ic acid2dependen t grow th inh ib it ion. Cancer R es, 1995, 55:578～ 584886 中国生物化学与分子生物学报 16卷

Relationship Between AP-1 Activity and RARα Involvement in Gastric Cancer Cells

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/6218/%e8%83%83%e7%99%8c%e7%bb%86%e8%83%9e%e4%b8%adAP_1%e6%b4%bb%e6%80%a7%e4%b8%8eRAR_%e4%bb%8b%e5%af%bc%e7%9a%84%e7%9b%b8%e5%85%b3%e6%80%a7.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Relationship Between AP-1 Activity and RARα Involvement in Gastric Cancer Cells

Abstract

Similar works

Full text

Available Versions

Xiamen University Institutional Repository