目的　探讨维甲酸α受体 (RARα)介导全反式维甲酸 (ATRA)抑制胃癌细胞生长的作用机理。方法　应用Northernblot分析维甲酸受体在胃癌细胞中的表达水平 ,通过脂质体转染方法将senseRARα和antisenseRARα分别转染到细胞中 ,通过MTT方法和软琼脂集落形成实验分析ATRA对转染细胞生长和恶性程度的影响 ,瞬时转染和测定氯霉素乙酰转移酶 (CAT)活性 ,分析维甲酸应答元件 (RARE)的转录活性。结果　ATRA诱导BGC 82 3细胞RARα表达 ,但不能诱导MKN 45细胞RARα表达。在转染细胞中 ,ATRA可以抑制转senseRARα的MKN细胞生长 ,但不能抑制转antisenseRARα的BGC细胞生长。与MKN 45细胞比较 ,ATRA诱导MKN/RARα细胞 βRARE的转录活性较高 ,但与BGC 82 3细胞比较 ,ATRA诱导BGC/aRARα细胞βRARE的转录活性则较低。 结论　足够量的RARα对于介导ATRA抑制胃癌细胞生长作用是必需的 
【英文摘要】 Objective To study the mechanism of retinoic acid receptor α(RARα) in mediating growth inhibition of gastric cancer cells by all trans retinoic acid(ATRA).Methods Expression of RAR s was detected by Northern blot. After anti sense RARα or sense RARα had been transfected into gastric cancer cell lines BGC 823 and MKN 45 respectively, the inhibitory effect of ATRA on cell growth in stable clones was analyzed using MTT assay and colony forming assay in soft agar. The transcriptional activation of retin...国家自然科学基金资助项目(39880015)；国家杰出青年科学基金(B类)资助项目(39825502

刘苏

吴乔

苏文金

陈正明

目的　探讨维甲酸α受体 (RARα)介导全反式维甲酸 (ATRA)抑制胃癌细胞生长的作用机理。方法　应用Northernblot分析维甲酸受体在胃癌细胞中的表达水平 ,通过脂质体转染方法将senseRARα和antisenseRARα分别转染到细胞中 ,通过MTT方法和软琼脂集落形成实验分析ATRA对转染细胞生长和恶性程度的影响 ,瞬时转染和测定氯霉素乙酰转移酶 (CAT)活性 ,分析维甲酸应答元件 (RARE)的转录活性。结果　ATRA诱导BGC 82 3细胞RARα表达 ,但不能诱导MKN 45细胞RARα表达。在转染细胞中 ,ATRA可以抑制转senseRARα的MKN细胞生长 ,但不能抑制转antisenseRARα的BGC细胞生长。与MKN 45细胞比较 ,ATRA诱导MKN/RARα细胞 βRARE的转录活性较高 ,但与BGC 82 3细胞比较 ,ATRA诱导BGC/aRARα细胞βRARE的转录活性则较低。 结论　足够量的RARα对于介导ATRA抑制胃癌细胞生长作用是必需的 
【英文摘要】 Objective To study the mechanism of retinoic acid receptor α(RARα) in mediating growth inhibition of gastric cancer cells by all trans retinoic acid(ATRA).Methods Expression of RAR s was detected by Northern blot. After anti sense RARα or sense RARα had been transfected into gastric cancer cell lines BGC 823 and MKN 45 respectively, the inhibitory effect of ATRA on cell growth in stable clones was analyzed using MTT assay and colony forming assay in soft agar. The transcriptional activation of retin...国家自然科学基金(39880015)；国家杰出青年科学基金(B 类，39825502)资

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基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (39880015) ;国家杰出青年科学基金 (B 类)资助项目 (39825502)作者单位 :361005 厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室·基础研究·维甲酸α受体介导全反式维甲酸抑制胃癌细胞生长的作用机理吴乔 　陈正明 　刘苏 　苏文金【摘要】　目的 　探讨维甲酸α受体 (RARα)介导全反式维甲酸 (ATRA) 抑制胃癌细胞生长的作用机理。方法 　应用 Northern blot 分析维甲酸受体在胃癌细胞中的表达水平 ,通过脂质体转染方法将sense RARα和 antisense RARα分别转染到细胞中 ,通过 MTT方法和软琼脂集落形成实验分析 ATRA 对转染细胞生长和恶性程度的影响 ,瞬时转染和测定氯霉素乙酰转移酶 (CAT) 活性 ,分析维甲酸应答元件 (RARE)的转录活性。结果 　ATRA 诱导 BGC2823 细胞 RARα表达 ,但不能诱导 MKN245 细胞 RARα表达。在转染细胞中 ,ATRA 可以抑制转 sense RARα的 MKN 细胞生长 ,但不能抑制转 antisense RARα的 BGC细胞生长。与 MKN245 细胞比较 ,ATRA 诱导 MKN/ RARα细胞βRARE 的转录活性较高 ,但与BGC2823 细胞比较 ,ATRA 诱导BGC/ aRARα细胞βRARE的转录活性则较低。结论 　足够量的 RARα对于介导 ATRA 抑制胃癌细胞生长作用是必需的。【主题词】　胃肿瘤 ; 维甲酸 ; 维甲酸α受体 ; 基因转染Mechanism of retinoic acid receptor α2mediated growth inhibition of gastric cancer cells by all2transretinoic acid 　WU Qiao , CHEN Zhengming , LIU Su , et al . The State Laboratory for Tumor Cell Engineering ,Xiamen University , Xiamen 361005 , China【Abstract】　Objective 　To study the mechanism of retinoic acid receptorα(RARα) in mediating growthinhibition of gastric cancer cells by all2trans retinoic acid(ATRA) . Methods 　Expression of RARs was detected byNorthern blot. After anti2sense RARαor sense RARαhad been transfected into gastric cancer cell lines BGC2823and MKN245 respectively , the inhibitory effect of ATRA on cell growth in stable clones was analyzed using MTTassay and colony forming assay in soft agar. The transcriptional activation of retinoic acid response element(RARE) was measured by CAT assay. Results 　ATRA could induce expression of RARα in BGC2823 cells , butnot in MKN245 cells. In stable clones , ATRA could inhibit growth of MKN245 cells transfected with RARαgene ,but could not inhibit that of BGC2823 cells transfected with antisense RARα. Transient transfection and CAT assayshowed higherβ2RAR response element (βRARE) transcriptional activation induced by ATRA in MKN245 cellstransfected with RARαgene compared to parental MKN245 cells , while lowerβRARE transcriptional activation wasseen in BGC cells transfected with antisense RARα gene compared to parental BGC2823 cells. ConclusionSufficient level of RARαis required for growth inhibition of gastric cancer cells by ATRA.【Subject words】　Stomach neoplasms ; Retinoic acid ; Retinoic acid receptorα; Gene transfection　　维甲酸 (retinoic acid , RA) 的作用主要由其受体———维甲酸受体 (retinoic acid receptor , RAR) 和维甲类 X受体 ( retinoid X receptor , RXR) 介导 ,它们属于类固醇/ 甲状腺激素受体超家族成员 ,由 3 种不同基因α、β和γ编码 ,由此形成不同的受体亚类[1 ] 。许多证据表明 ,RAR 活性的改变与某些疾病相关。在急性早幼粒细胞白血病中 ,当染色体发生 t (15 ;17)易位时 ,导致异常 PML2RARα融合受体的产生 ,并引起非正常的 RARα转录[2 ] 。在肺癌中 ,靠近 RARβ基因区的染色体 3P 短臂经常发生缺失[3 ] ,人乳腺癌细胞由于不表达 RARβ而对 RA 产生抗性[4 ] 。因此 ,探讨 RAR 的功能作用对于阐明 RA 的抗癌机制具有重要意义。材料与方法　　11 胃癌细胞株和药物处理 :BGC2823 和 MKN245细胞购于上海细胞所细胞库 ,RPMI21640 培养液培养。10 - 6 mol/ L 全反式维甲酸 (all2trans retinoic acid ,ATRA ; Sigma 公司)处理细胞。21RNA 提取和 Northern blot :细胞经 ATRA 处理·591·中华肿瘤杂志 2000 年 5 月第 22 卷第 3 期　Chin J Oncol , May 2000 , Vol 22 , No. 324 h 后 ,硫氰酸胍提取和氯化铯超速离心制备总RNA ,Northern blot 按文献 [ 5 ] 方法。探针 RARα、RARβ、RARγ和 RXRα由美国加州 Burnham 研究所张晓坤博士惠赠。以 28S 和 18S 定量所用的 RNA 量。31 基因转染和细胞形态观察 :克隆有 antisenseRARα和 sense RARα质粒的表达载体 (张晓坤博士惠赠)通过脂质体 ( Gibco BRL) 介导方法转染到细胞中 ,空白载体 (pRC/ CMV)作为对照 , G418 筛选细胞 ,Northern blot 确定 RARα表达 ,观察克隆细胞形态。41 细胞生长测定 :以 1 000 细胞/ 孔接种量将细胞接种在 96 孔板 ,ATRA 处理细胞 9 d ,MTT[ 32(4 ,52dimethylthiazol262yl )26 , 52diphenyltetrazolium bromide ]方法测定细胞生长率[6 ] 。51 软琼脂集落形成测定 :0. 5 %琼脂作为底层 ,在 0. 3 %琼脂中加入细胞 ,使细胞终浓度为 1 ×105/ml (实验组则同时加入 ATRA) ,混匀后取 1 ml 铺展在底层琼脂上 ,凝固后置 CO2 培养箱中培养 ,3 周后计数集落形成数 (直径 > 80μm 集落为阳性) 。61DNA 瞬时转染和氯霉素乙酰转移酶 (CAT) 测定 :脂质体介导方法将报告基因βRARE2tk2CAT(张晓坤博士惠赠)瞬时转染到细胞中 ,转染后 ,细胞经ATRA 处理 24 h ,测定 CAT活性[6 ] 。结 果　　11RARα、RARβ、RARγ和 RXRα在胃癌细胞中的表达 :Northern blot 分析表明 ,RARα在 BGC2823 细胞中表达水平较高 ,在 MKN245 细胞中表达水平很低。ATRA 诱导后 ,BGC2823 细胞 RARα表达水平显著提高 ,而 MKN245 细胞 RARα表达水平不变。RARβ在BGC2823 细胞表达 ,在 MKN245 细胞不表达 ; RARγ在两株细胞中均不表达 ,RXRα在两株细胞中低水平表达。然而 ,ATRA 都不能诱导两株细胞的 RARβ、RARγ和 RXRα表达 (图 1) 。21 转染基因在胃癌细胞中的表达 :根据以上结果 ,将 antisense RARα和 sense RARα分别转染到BGC2823 和 MKN245 细胞。Northern blot 显示 ,BGC/aRARα细胞的 RARα表达受到抑制 ,表达水平比BGC2823 细胞低 ,而且 ATRA 不能诱导其表达 ,但可以诱导转空白载体细胞 BGC/ vector 的 RARα表达(图 2A) 。相反 ,MKN/ RARα细胞的 RARα表达不仅比 MKN245 细胞提高 ,而且 ATRA 能够诱导其表达 ,但不能诱导 MKN/ vector 的 RARα表达 (图 2B) 。与MKN245 细胞多边形形态比较 ,MKN/ RARα细胞变为细长形 ,突起消失 ,圆形细胞增多 ,而 BGC/ aRARα细胞形态则与 BGC2823 细胞类似。图 1 　ATRA 对胃癌细胞中 RARα、RARβ和RXRα转录水平的影响A :BGC/ aRARα细胞 ;B :MKN/ RARα细胞图 2 　RARα在转染细胞中的表达31ATRA 对细胞生长的影响 :ATRA 可以有效抑制 BGC2823 细胞生长 ,但不能有效抑制 BGC/ aRARα细胞生长 ,抑制率从 61. 0 %下降到 18. 4 %。相反 ,ATRA 不能抑制 MKN245 细胞生长 , 但可以抑制·691· 中华肿瘤杂志 2000 年 5 月第 22 卷第 3 期　Chin J Oncol , May 2000 , Vol 22 , No. 3MKN/RARα 细胞生长 , 抑制率从 3. 9 % 上升到31. 7 %。41ATRA 对细胞软琼脂集落形成能力的影响 :ATRA 可以抑制 BGC2823 和 MKN245 细胞在软琼脂中形成集落的能力 ,但对 BGC2823 细胞的抑制率(35. 7 %) 比对 MKN245 细胞的抑制率 (23. 2 %) 高。相反 ,转染细胞中 ATRA 对 MKN/ RARα细胞形成集落的 抑 制 率 ( 96. 1 %) 大 于 BGC/ aRARα 细 胞(20. 0 %) 。51ATRA 对维甲酸应答元件βRARE 转录活性的调节 : 当报告基因βRARE2tk2CAT 瞬时转染后 ,在BGC2823 细胞中 ,ATRA 可以诱导一个较强的 CAT活性 ,诱导倍数 (即 ATRA 诱导的 CAT 活性/ 对照组的 CAT活性)为 3. 36 ,而对MKN245 细胞的诱导倍数为 1. 3。相反 ,转染细胞中 ATRA 不能显著诱导BGC/ aRARα细胞的 CAT活性 ,诱导倍数仅为 1. 8 ,但对 MKN/ RARα细胞的诱导倍数则上升为 2. 75。讨 论　　RA 的作用主要由其受体 RARS 和 RXRS 介导。Northern blot 分析表明 ,ATRA 可以诱导 BGC2823 细胞 RARα表达 ,但不能诱导 RARβ、RARγ和 RXRα表达 ,提示 RARα可能参与 ATRA 抑制胃癌细胞生长的过程。RA 激活的 RARα与 RXR 形成异源二聚体 ,可以结合到维甲酸应答元件 (如βRARE) 上 ,由此调控基因的转录和表达[4 ] 。在急性早幼粒白血病细胞和 RA 抗性的成神经细胞瘤细胞中 ,RA 可以诱导 RARα表达 ,这种上调作用是由于 RA 诱导 RARα基因启动子上的 RARE 基元序列 (motif) [7 ] 。本研究中 ,当报告基因βRARE2tk2CAT转染到 BGC2823 细胞时 ,ATRA 可以显著诱导βRARE 活性 (即 CAT 活性) ,表明 BGC2823 细胞的 RARα具有功能性 ,在ATRA 存在下激活βRARE 而刺激细胞生长抑制信号 ,从而抑制 BGC2823 细胞生长。但是 ,当报告基因转染到 MKN245 细胞时 ,ATRA 诱导的βRARE 活性很低 ,提示在 MKN245 细胞中βRARE 转录调节可能发生异常 ,或者 RARα功能丧失 ,ATRA 不能抑制MKN245 细胞生长。在成神经细胞瘤中 ,低水平表达 RARα与预后效果差密切相关[8 ] ,这是由于 RARα受体反映了肿瘤分化的特殊阶段。已知 RARα在人组织分化过程中具有重要作用 ,在造血细胞中 ,RARα表达丰富 ,但当染色体发生 t (15 ;17) 和 t (11 ;17) 易位时 ,RARα受体发生变化 ,导致造血细胞分化受阻[9 ] 。当将 senseRARα基因转染到 MKN245 细胞时 , ATRA 通过对RARα的诱导而抑制细胞生长和降低细胞形成集落的能力。相反 ,当 antisense RARα转染到 BGC2823 细胞后 ,ATRA 不能诱导 RARα表达 ,细胞由对 ATRA敏感转为抗性 ,形成集落的能力上升。由此证实 ,RARα在介导 ATRA 抗胃癌细胞生长和抑制细胞恶性化方面起着关键作用。RARα功能丧失可能导致细胞失去这种调节机制 ,从而表现出对 ATRA 抗性。另外 ,当 RARα基因转染到 MKN245 细胞后 ,细胞形态由多边形变为细长形 ,圆形细胞数量增多 ,这种变化与 ATRA 存在与否无关 ,表明细胞形态的改变是由于基因转染引起的。至于圆形细胞的增多是否与细胞凋亡或其他因素有关 ,尚需进一步研究。参 考 文 献1 Zhang XK, Pfahl M. Regulation of retinoid and thyroid hormone actionthrough homodimeric and heterodimeric receptors. Trends EndocrinolMetab , 1993 , 4 :1562162.2 Grignaini F , Fagioli M , Alcalay M , et al . Acute promyelocytic leukemiafrom genetics to treatment . Blood , 1994 , 83 :10217.3 Gebert JF , Moghal N , Frangioni JV , et al . High frequence of retinoicacid receptorβabnormalities in human lung cancer. Oncogene , 1991 ,6 :185621863.4 Lui Y, Lee MO , Wang HG, et al . Retinoic acid receptorβmediates thegrowth2inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in humanbreast cancer cells. Mol Cell Biol , 1996 , 16 :113821149.5 Sambrook J , Fritsch EF , Maniatis T. Molecular cloning : a laboratorymanual. 2nd ed. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press ,1993. 10211.6 吴乔 ,曾定 ,苏文金 ,等. 视黄酸受体转录水平的改变与乳腺癌细胞生长的关系. 厦门大学学报 (自然科学版) ,1997 ,36 :787279417 Smarda J , Sugarman J , Glass C , et al . Retinoic acid receptor alphasuppresses transformation by v2myb. Mol Cell Biol , 1995 , 15 : 247422492.8 Marshall GM , Cheung B , Stacey KP , et al . Regulation of retinoic acidreceptor alpha expression in human neuroblastoma cell lines and tumortissue. Anticancer Res , 1993 , 13 :4372449.9 Grihnagni F , Ferruci PF , Testa U , et al . The acute promyelocyticleukemia2specific PML2RAR2alpha fusion protein inhibits differentiationand promotes survival of myeloid precursor cells. Cell , 1993 , 74 :4232448.(收稿日期 :1999210218)·791·中华肿瘤杂志 2000 年 5 月第 22 卷第 3 期　Chin J Oncol , May 2000 , Vol 22 , No. 3

Mechanism of retinoic acid receptor α-mediated growth inhibition of gastric cancer cells by all-trans retinoic acid

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/6233/%e7%bb%b4%e7%94%b2%e9%85%b8_%e5%8f%97%e4%bd%93%e4%bb%8b%e5%af%bc%e5%85%a8%e5%8f%8d%e5%bc%8f%e7%bb%b4%e7%94%b2%e9%85%b8%e6%8a%91%e5%88%b6%e8%83%83%e7%99%8c%e7%bb%86%e8%83%9e%e7%94%9f%e9%95%bf%e7%9a%84%e4%bd%9c%e7%94%a8%e6%9c%ba%e7%90%86.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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