目的　探讨 G蛋白调节子 16 (RGS16 )对大鼠胶质瘤C6细胞的生物学特性的影响 .方法　利用脂质体介导法将RGS16基因导入 C6细胞中 ,在倒置显微镜下观察细胞形态变化和贴壁情况 ;3H- Td R法检测 C6细胞在转染不同梯度p CMV5 - RGS16和 p CMV 5质粒后的增殖情况 ;免疫细胞化学法检测转染前后 RGS16蛋白的表达情况 ;流式细胞仪检测转染 p CMV5 - RGS16和 p CMV5质粒 36 h后细胞周期变化和细胞是否有凋亡发生 .结果　转染 p CMV5 - RGS16质粒 2 4 h后 30 %细胞贴壁性降低 ,突起收缩 ,细胞变圆 ;RGS16蛋白表达阳性 ;3H- Td R法检测显示 C6细胞增殖速度与转染p CMV5 - RGS16的量呈正相关 ;细胞周期结果显示 G1期细胞百分数减少 10 % ,而 S期细胞百分数增多 14 % ;未发现RGS16与凋亡有直接关系 .结论　 RGS16可能促进 C6细胞的增殖 . 
【英文摘要】 s: AIM To study the effect of RGS16 on the biological characteristics of glioma C6 cells. METHODS pCMV5 RGS16 was transfected into C6 cells by lipofectin. The morphological and adhesive changes of the cells were observed under an inverted microscope. Proliferation of C6 cells was measured by 3H thymidine ( 3H TdR) assay after gradient transfections of pCMV5 RGS16 and pCMV5. Expression of RGS16 was examined by immunocytochemical method both before and after the transfection. Flow cytometry ...高等学校骨干教师计划资

叶菁(第四军医大学西京医院病理科)

张丰(第四军医大学西京医院病理科)

李青(第四军医大学西京医院病理科)

林圣彩(新加坡国立大学分子细胞生物学研究所)

王莉(第四军医大学西京医院病理科)

章必成(第四军医大学西京医院病理科)

陈广生(第四军医大学西京医院病理科)

目的　探讨 G蛋白调节子 16 (RGS16 )对大鼠胶质瘤C6细胞的生物学特性的影响 .方法　利用脂质体介导法将RGS16基因导入 C6细胞中 ,在倒置显微镜下观察细胞形态变化和贴壁情况 ;3H- Td R法检测 C6细胞在转染不同梯度p CMV5 - RGS16和 p CMV 5质粒后的增殖情况 ;免疫细胞化学法检测转染前后 RGS16蛋白的表达情况 ;流式细胞仪检测转染 p CMV5 - RGS16和 p CMV5质粒 36 h后细胞周期变化和细胞是否有凋亡发生 .结果　转染 p CMV5 - RGS16质粒 2 4 h后 30 %细胞贴壁性降低 ,突起收缩 ,细胞变圆 ;RGS16蛋白表达阳性 ;3H- Td R法检测显示 C6细胞增殖速度与转染p CMV5 - RGS16的量呈正相关 ;细胞周期结果显示 G1期细胞百分数减少 10 % ,而 S期细胞百分数增多 14 % ;未发现RGS16与凋亡有直接关系 .结论　 RGS16可能促进 C6细胞的增殖 .
【英文摘要】 s: AIM To study the effect of RGS16 on the biological characteristics of glioma C6 cells. METHODS pCMV5 RGS16 was transfected into C6 cells by lipofectin. The morphological and adhesive changes of the cells were observed under an inverted microscope. Proliferation of C6 cells was measured by 3H thymidine ( 3H TdR) assay after gradient transfections of pCMV5 RGS16 and pCMV5. Expression of RGS16 was examined by immunocytochemical method both before and after the transfection. Flow cytometry ...高等学校骨干教师计划资

李青(第四军医大学基础部病理学教研室

林圣彩

Xiamen University Institutional Repository

·研究原著· 文章编号: 100022790 (2002) 1020950203过度表达 G 蛋白调节子 16 促进大鼠胶质瘤C6 细胞增殖张　丰1, 李　青1, 章必成1, 叶　菁1, 陈广生1, 王　莉1, 林圣彩2(1 第四军医大学西京医院病理科, 陕西 西安 710033; 2 新加坡国立大学分子细胞生物学研究所, 新加坡 117609)关键词: 调节子; G 蛋白; 转染; 细胞周期中图号: R 739. 41　　　文献标识码: A摘　要: 目的　探讨 G 蛋白调节子 16 (R GS16)对大鼠胶质瘤C6 细胞的生物学特性的影响. 方法　利用脂质体介导法将R GS16 基因导入C6 细胞中, 在倒置显微镜下观察细胞形态变化和贴壁情况; 3H 2T dR 法检测 C6 细胞在转染不同梯度pCM V 52R GS16 和 pCM V 5 质粒后的增殖情况; 免疫细胞化学法检测转染前后R GS16 蛋白的表达情况; 流式细胞仪检测转染pCM V 52R GS16 和pCM V 5 质粒 36 h 后细胞周期变化和细胞是否有凋亡发生. 结果　转染 pCM V 52R GS16 质粒 24 h后 30% 细胞贴壁性降低, 突起收缩, 细胞变圆; R GS16 蛋白表达阳性; 3H 2T dR 法检测显示 C6 细胞增殖速度与转染pCM V 52R GS16 的量呈正相关; 细胞周期结果显示 G1 期细胞百分数减少 10% , 而 S 期细胞百分数增多 14% ; 未发现R GS16 与凋亡有直接关系. 结论　R GS16 可能促进C6 细胞的增殖.Prom otion of gl ioma C6 cells prol ifera tion byoverexpressed RGS16ZH A N G F eng1, L I Q ing 1, ZH A N G B i2Cheng 1,Y E J ing1, CH EN Guang 2S heng 1, W A N G L i1,L IN S heng 2Ca i21D epartm en t of Pa tho logy, X ijing Ho sp ita l, Fou rthM ilita ry M edica l U n iversity, X i’an 710033, Ch ina,2 In st itu te of M o lecu lar & Cell B io logy, N at iona lU n iversity of Singapo re, Singapo re 117609Keywords: regu lon; G2p ro tein s; t ransfect ion; cell cycle收稿日期: 2001211220; 　修回日期: 2001212220基金项目: 高等学校骨干教师计划资助通讯作者: 李　青. T el. ( 029 ) 3376957 　 Em ail. L iqing @fmm u.edu. cn作者简介: 张　丰 (19752) , 男 (汉族) , 山西省稷山县人. 硕士生 (导师李青). T el. (029) 3374541 Ext. 119　Em ail. cyp ress1975@ 263.netAbstracts: A IM 　 To study the effect of R GS16 on theb io logical characterist ics of gliom a C6 cells. M ETHOD S　pCM V 52R GS16 w as transfected in to C6 cells by lipofect in.T he mo rpho logical and adhesive changes of the cells w ereobserved under an inverted m icro scope. P ro liferat ion of C6cells w as m easu red by 3H 2thym idine ( 3H 2T dR ) assay aftergradien t transfect ions of pCM V 52R GS16 and pCM V 5.Exp ression of R GS16 w as exam ined by imm unocytochem icalm ethod bo th befo re and after the transfect ion. F lowcytom etry w as adop ted to m easu re changes in the fract ionnum ber of the cell cycle phase and to detect w hether R GS16cou ld induce apop to sis of C6 cell. RESUL TS　24 hours afterthe transfect ion of pCM V 52R GS16 app rox im ately 30% of C6cells grew round and 13% exp ressed R GS16; 36 h later thepo sit ive relat ionsh ip betw een the p ro liferat ion of C6 cells andthe gradien t transfect ions of pCM V 52R GS16 w as disp layed by3H 2T dR assay. F low cytom etry show ed that the fract ionnum ber of G1 phase of C6 cells reduced by 10% and that of Sphase accum ulated by 14% and R GS16 cou ld no t induceapop to sis of C6 cells. CONCL USION 　 R GS16 m igh tp romo te the p ro liferat ion of C6 cells.0　引言G 蛋白在丝裂原激活蛋白激酶 (m itogen2act iva ted p ro tein k inases, M A PK) 引起细胞增殖和分化的信号转导过程中起重要调控作用[ 1 ]. G 蛋白调节子 ( regu la to rs of G p ro tein signa ling, R GS) 是近年来新发现的参与 G 蛋白信号转导的一个大家族, 主要功能是负调节 GΑi 和 GΑq 亚基, 其成员超过20 种[ 2 ]. 1997 年我们[ 3 ] 在小鼠垂体内克隆了R GS16, 并发现其在肝、垂体和脑组织内表达丰富.最近发现R GS16 可能参与细胞的应激反应[ 4- 7 ]. 根据文献检索 R GS16 在胶质瘤中的作用尚未见报道,因此, 我们将外源性基因R GS16 导入C6 细胞, 观察其对细胞的影响, 为确定 R GS16 蛋白的功能和其在C6 细胞信号转导中的作用提供依据.059 第四军医大学学报 (J Fou rth M ilM ed U niv) 2002; 23 (10)© 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net1　材料和方法1. 1 　材料　大鼠胶质瘤细胞 C6: 本室保存;pCM V 52R GS16, pCM V 5 和 R GS16 抗体: 新加坡国立大学林圣彩教授惠赠; 脂质体: Gibco 公司; 3H 2T dR: 上海原子能研究所; 免疫组化试剂盒: 武汉博士德公司; DNA 2P rep 试剂盒: 美国Cou lter 公司.1. 2　方法1. 2. 1　基因转染[ 8 ]　C6 细胞在含 150 mL ·L - 1小牛血清的 R PM I1640 培养液中常规培养, 细胞生长至对数期时以 1×105ö孔接种于 6 孔培养板. 将pCM V 52R GS16 3 Λg 和脂质体 10 ΛL 分别溶于无血清培养液 100 ΛL , 两溶液缓慢混匀, 室温放置 30m in, 加入无血清培养液 0. 8 mL , 混匀后加入上述 6孔 培 养 板 中, 常 规 培 养 4 h 后, 每 孔 加 入 含150 mL ·L - 1小牛血清的 R PM I1640 培养液 2 mL.同样方法转染 pCM V 5 作为对照. 只加脂质体每孔10 ΛL 和未处理组各 3 孔作为阴性对照. 阳性率计算: 在随机一显微镜视野下, 阳性率 = R GS16 蛋白表达阳性的细胞数×100% ö总细胞数. 转染 24 h 后分别在倒置显微镜下观察细胞的形态变化.1. 2. 2　3H 2T dR 掺入法[ 9 ]　取对数生长期细胞, 消化后制成 1×109·L - 1细胞悬液, 按每孔 100 ΛL 接种于 96 孔培养板, 培养 4 h, 细胞贴壁. 将 pCM V 52R GS16 和 pCM V 5 质粒分别按 4 组不同梯度 (90,180, 270, 360 ngö孔) , 与 0. 8 ΛL 脂质体分别溶于 25ΛL 无血清培养液, 每个梯度 3 孔, 两溶液缓慢混匀,室温放置 30 m in, 混匀后加入上述已接种细胞的 96孔培养板中, 24 h 后每孔加3H 2T dR 1. 85×104 Bq(50 ΛL ) , 继续培养 12 h, 吸取上清液, PBS 洗涤 3 次后测3H 2T dR 掺入率.1. 2. 3　免疫细胞化学染色　转染同时制备细胞爬片, 转染后 36 h 取出, PBS 洗涤 2 次×3 m in; 950mL ·L - 1乙醇固定 30 m in, 加兔抗鼠 R GS16 抗体(1∶50) , 4℃ 过夜, PBS 洗涤 3 次×5 m in; 加入即用型羊抗兔, 室温放置 30 m in, PBS 洗涤 3 次×5 m in;加入 SABC 复合物, 室温放置 30 m in, PBS 洗涤 3 次×5 m in; DAB 显色, 苏木精衬染.1. 2. 4　细胞周期和凋亡分析　36 h 后取 4 组细胞各约 1×106 个, 经胰酶消化制成单细胞悬液, 离心 2次, 每次 PBS 4 mL 洗涤. 700 mL ·L - 1乙醇固定,DNA 染色后用流式细胞仪检测细胞周期变化和是否有凋亡峰出现.统计学处理: 采用 t 检验进行统计学分析.2　结果2. 1　细胞形态变化　转染 pCM V 52R GS16 24 h 后,倒置显微镜下显示细胞贴壁性降低, 突起收缩, 细胞变圆. 对照组未见明显变化 (F ig 1).2. 2　3H-TdR 掺入法　转染 pCM V 52R GS16 组放射值随转染质粒 DNA 量的增加而明显升高. 转染pCM V 5 组放射值变化不明显. 统计表明两组之间有显著差异 (P < 0. 01, T ab 1).表 1　pCM V 52R GS16 组和 pCM V 5 组不同梯度的3H 2T dR 值T ab 1　3H 2T dR values of pCM V 52R GS16 group and pCM V 5group (n= 3, xθ±s)Group 90ng 180ng 270ng 360ngPCM V 5 740±13 690±42 780±14 709±29PCM V 52RGS16b 733±12 899±32 1037±26 1209±19bP < 0. 01 vs pCM V 5.2. 3 　免疫细胞化学　转染 pCM V 52R GS16 组R GS16 蛋白表达阳性 (阳性率 13% , F ig 2) ; 转染pCM V 5 组脂、质体组和未处理组 R GS16 蛋白表达阴性.图 1　转染 pCM V 52R GS16 24 h 后C6 细胞形态变化F ig 1　M o rpho logical and adhesive changes of the cells 24 hafter transfect ion of pCM V 52R GS16　×100图 2　转染 pCM V 52R GS16 36 h 后C6 细胞R GS16 蛋白表达阳性F ig 2 　 Exp ression of R GS16 in C6 cells 36 h aftertransfect ion of pCM V 52R GS16　SABC　×100159第四军医大学学报 (J Fou rth M ilM ed U niv) 2002; 23 (10)© 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net2. 4　细胞周期和凋亡分析　转染 pCM V 52R GS16组细胞周期 G1 期细胞比例减少, S 期增多. pCM V 5组、脂质体组和未处理组细胞周期变化不明显 (T ab2). 未发现有凋亡峰出现.表 2　流式细胞仪检测各组细胞周期T ab 2　Cell cycle assay by cytom etryGroup G1 S G2N o rm al 0. 70 0. 21 0. 09L ipofectin 0. 73 0. 19 0. 08PCM V 5 0. 73 0. 18 0. 09PCM V 52RGS16 0. 60 0. 35 0. 053　讨论R GS 蛋白家族是一组含有约 120 个氨基酸在进化上很保守的R GS 结构域的蛋白质. 它们主要直接与 G 蛋白的 GΑi 和 GΑq 亚基结合, 通过上调 G 蛋白Α亚基的 GT P 酶活性, 促进 G 蛋白 Α亚基和 ΒΧ亚基的结合, 从而负调节 G 蛋白的活性, 并间接负调节 G蛋白对M A PK 的激活[ 2 ]. 1997 年我们[ 3 ]在小鼠垂体克隆了 R GS16 并发现其可以代替酵母细胞中一种R GS 蛋白 SST 2 的功能, 使停滞于 G1 期的酵母细胞恢复增殖状态. 后来我们[ 4 ]又发现 R GS16 可以减弱血小板激活因子对 p 38M A PK 的激活作用; 并且在CEM 细胞中蛋白激酶 C 可以通过上调 TN F2Α而诱导 R GS16 的表达[ 5 ]. Buckb inder 等[ 6 ] 和 Beadling等[ 7 ]曾分别发现 p 53 和 IL 22 也可以诱导 R GS16 的表达. 因此我们推测R GS16 可能参与细胞的凋亡和应激反应 . 我们将pCM V 52R GS16 转入C6 细胞后,发现细胞贴壁性降低, 星状突起收缩, 细胞变圆; 36 h后 R GS16 蛋白表达阳性; 3H 2T dR 掺入法结果显示R SG16 明显促进C6 细胞的增殖; 流式细胞仪结果表明 R GS16 促进了 G1 期的细胞加快向 S 期过渡, 使G1 期细胞百分数下降而 S 期细胞百分数增加; 但实验结果未发现R GS16 与凋亡的直接关系.本研究表明, R GS16 可以促进胶质瘤C6 细胞的增殖, 有类似 SST 2 在酵母细胞中的作用[ 3 ]. 由于SST 2 通过下调G 蛋白活性从而减弱主要通过RA SöRA FöM A PK 通路传递到细胞核内的信号, 使C ln1p 2Cdc28 和C ln2p 2Cdc28 活化, 促进细胞增殖[ 10 ]. 因此我们推测R GS16 也可能通过间接调节Cdc28 而调节C6 细胞周期的运行. 但由于哺乳动物细胞信号转导的复杂性以及胶质瘤 C6 细胞内基因突变造成信号转导通路与正常细胞之间的差异性[ 11 ] , 因此也不能排除R GS16 通过其他信号转导通路调节C6 细胞周期的运行. 由于本实验未发现 R GS16 与凋亡的关系, 因此R GS16 与p 53, p 38M A PK, TN F2Α以及 IL 22 之间的关系在细胞增殖和凋亡中的作用还有待于进一步探索.参考文献:[ 1 ] Guderm ann T , Gro sse R , Schultz G. Contribu tin of recep to röG2p ro tein signaling to cell grow th and transfo rm ation [ J ].N auny n S chm ied eberg s A rch P harm acol, 2000; 361 ( 1 ) :345- 362.[ 2 ] Burchett SA. Regulato rs of G p ro tein signaling: A bestiary ofmodular p ro tein b inding dom ains [ J ]. J N eu rochem , 2000;75 (4) : 1335- 1351.[ 3 ] Chen C, Zheng B, H an J , L in SC. Characterization of a novelm amm alian RGS p ro tein that b inds to galpha p ro teins andinh ib its pheromone signaling in yeast [J ]. J B iol Chem , 1997;272 (13) : 8679- 8685.[ 4 ] Zhang Y, N eo SY, H an J , Yaw L P, L in SC. RGS16 attenuatesgalphaq2dependent p38 m itogen2activated p ro tein k inaseactivation by p latelet2activating facto r [J ]. J B iol Chem , 1999;274 (5) : 2851- 2857.[ 5 ] Tong CW , Zhang Y, N eo SY, L in SC. Specific induction ofRGS16 ( regulato r of G2p ro tein signaling 16) mRNA by p ro teink inase C in CEM leukaem ia cells is m ediated via tumo r necro sisfacto r Α in calcium 2sensit ive m anner [ J ]. B iochem J , 2000;352 (3) : 747- 753.[ 6 ] Buckbinder L , M igul SV , Chen Y, Xu N Z, T alo tt t R , GelbertL , Gao J , Seizinger BR , Gutk ind JS, Kly N. T he p53 tumo rsupp resso r targets a novel regu lato r of G p ro tein signaling [J ].P roc N atl A cad S ci U SA , 1997; 94 (15) : 7868- 7872.[7 ] Beadling C, D ruey KM , R ich ter G, Keh rl JH , Sm ith KA.Regulato rs of G p ro tein signaling exh ib it dist inct patterns ofgene exp ression and target G p ro tein specificity in hum anlymphocytes [J ]. J Imm unol, 1999; 162 (5) : 2677- 2682.[8 ] Pan Y, H uang W , A i YF. In teraction of p ro liferation betw eenvascu lar endo thelial cell and smoo th m uscle cell of rabb its inv itro [J ]. D i2si J uny i D ax ue X uebao (J F ou rth M il M ed U niv ) ,2001; 22 (1) : 12- 15.[ 9 ] Zhang BC, L iQ , Ye J , W ang YM. p38M A PK gene transfectioncan induce the apop to sis of gliom a cells C6 [ J ]. D i2si J uny iD ax ue X uebao ( J F ou rth M il M ed U niv ) , 2001; 22 ( 3 ) :211- 213.[ 10 ] Chen T , Kurjan J. Saccharom yces cerevisiae. M p t5p in teractsw ith Sst2p and p lays ro les in pheromone sensit ivity and recoveryfrom pheromone arrest [ J ]. M ol Cell B iol, 1997; 17 ( 6 ) :3429- 3439.[ 11 ] Ho lland EC. Gliom agenesis: Genetic alterations and mousemodels [J ]. N at R ev Genet, 2001; 2 (2) : 120- 129.编辑　王　睿259 第四军医大学学报 (J Fou rth M ilM ed U niv) 2002; 23 (10)© 1994-2006 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net

Promotion of glioma C6 cells proliferation by overexpressed RGS16

目的　探讨 G蛋白调节子 16 (RGS16 )对大鼠胶质瘤C6细胞的生物学特性的影响 .方法　利用脂质体介导法将RGS16基因导入 C6细胞中 ,在倒置显微镜下观察细胞形态变化和贴壁情况 ;3H- Td R法检测 C6细胞在转染不同梯度p CMV5 - RGS16和 p CMV 5质粒后的增殖情况 ;免疫细胞化学法检测转染前后 RGS16蛋白的表达情况 ;流式细胞仪检测转染 p CMV5 - RGS16和 p CMV5质粒 36 h后细胞周期变化和细胞是否有凋亡发生 .结果　转染 p CMV5 - RGS16质粒 2 4 h后 30 %细胞贴壁性降低 ,突起收缩 ,细胞变圆 ;RGS16蛋白表达阳性 ;3H- Td R法检测显示 C6细胞增殖速度与转染p CMV5 - RGS16的量呈正相关 ;细胞周期结果显示 G1期细胞百分数减少 10 % ,而 S期细胞百分数增多 14 % ;未发现RGS16与凋亡有直接关系 .结论　 RGS16可能促进 C6细胞的增殖高等学校骨干教师计划资

·研究原著· 文章编号: 100022790 (2002) 1020950203过度表达 G 蛋白调节子 16 促进大鼠胶质瘤C6 细胞增殖张　丰1, 李　青1, 章必成1, 叶　菁1, 陈广生1, 王　莉1, 林圣彩2(1 第四军医大学西京医院病理科, 陕西 西安 710033; 2 新加坡国立大学分子细胞生物学研究所, 新加坡 117609)关键词: 调节子; G 蛋白; 转染; 细胞周期中图号: R 739. 41　　　文献标识码: A摘　要: 目的　探讨 G 蛋白调节子 16 (R GS16)对大鼠胶质瘤C6 细胞的生物学特性的影响. 方法　利用脂质体介导法将R GS16 基因导入 C6 细胞中, 在倒置显微镜下观察细胞形态变化和贴壁情况; 3H 2T dR 法检测 C6 细胞在转染不同梯度pCM V 52R GS16 和 pCM V 5 质粒后的增殖情况; 免疫细胞化学法检测转染前后 R GS16 蛋白的表达情况; 流式细胞仪检测转染pCM V 52R GS16 和pCM V 5 质粒 36 h 后细胞周期变化和细胞是否有凋亡发生. 结果　转染 pCM V 52R GS16 质粒 24 h后 30% 细胞贴壁性降低, 突起收缩, 细胞变圆; R GS16 蛋白表达阳性; 3H 2T dR 法检测显示 C6 细胞增殖速度与转染pCM V 52R GS16 的量呈正相关; 细胞周期结果显示 G1 期细胞百分数减少 10% , 而 S 期细胞百分数增多 14% ; 未发现R GS16 与凋亡有直接关系. 结论　R GS16 可能促进 C6 细胞的增殖.Prom otion of gl ioma C6 cells prol ifera tion byoverexpressed RGS16ZH A N G F eng1, L I Q ing 1, ZH A N G B i2Cheng 1,Y E J ing1, CH EN Guang 2S heng 1, W A N G L i1,L IN S heng 2Ca i21D epartm en t of Pa tho logy, X ijing Ho sp ita l, Fou rthM ilita ry M edica l U n iversity, X i’an 710033, Ch ina,2 In st itu te of M o lecu lar & Cell B io logy, N at iona lU n iversity of Singapo re, Singapo re 117609Keywords: regu lon; G2p ro tein s; t ransfect ion; cell cycle收稿日期: 2001211220; 　修回日期: 2001212220基金项目: 高等学校骨干教师计划资助通讯作者: 李　青. T el. ( 029 ) 3376957 　 Em ail. L iqing @fmm u.edu. cn作者简介: 张　丰 (19752) , 男 (汉族) , 山西省稷山县人. 硕士生 (导师李青). T el. (029) 3374541 Ext. 119　Em ail. cyp ress1975@ 263.netAbstracts: A IM 　 To study the effect of R GS16 on theb io logical characterist ics of gliom a C6 cells. M ETHOD S　pCM V 52R GS16 w as transfected in to C6 cells by lipofect in.T he mo rpho logical and adhesive changes of the cells w ereobserved under an inverted m icro scope. P ro liferat ion of C6cells w as m easu red by 3H 2thym idine ( 3H 2T dR ) assay aftergradien t transfect ions of pCM V 52R GS16 and pCM V 5.Exp ression of R GS16 w as exam ined by imm unocytochem icalm ethod bo th befo re and after the transfect ion. F lowcytom etry w as adop ted to m easu re changes in the fract ionnum ber of the cell cycle phase and to detect w hether R GS16cou ld induce apop to sis of C6 cell. RESUL TS　24 hours afterthe transfect ion of pCM V 52R GS16 app rox im ately 30% of C6cells grew round and 13% exp ressed R GS16; 36 h later thepo sit ive relat ionsh ip betw een the p ro liferat ion of C6 cells andthe gradien t transfect ions of pCM V 52R GS16 w as disp layed by3H 2T dR assay. F low cytom etry show ed that the fract ionnum ber of G1 phase of C6 cells reduced by 10% and that of Sphase accum ulated by 14% and R GS16 cou ld no t induceapop to sis of C6 cells. CONCL USION 　 R GS16 m igh tp romo te the p ro liferat ion of C6 cells.0　引言G 蛋白在丝裂原激活蛋白激酶 (m itogen2act iva ted p ro tein k inases, M A PK) 引起细胞增殖和分化的信号转导过程中起重要调控作用[ 1 ]. G 蛋白调节子 ( regu la to rs of G p ro tein signa ling, R GS) 是近年来新发现的参与 G 蛋白信号转导的一个大家族, 主要功能是负调节 GΑi 和 GΑq 亚基, 其成员超过20 种[ 2 ]. 1997 年我们[ 3 ] 在小鼠垂体内克隆了R GS16, 并发现其在肝、垂体和脑组织内表达丰富.最近发现R GS16 可能参与细胞的应激反应[ 4- 7 ]. 根据文献检索R GS16 在胶质瘤中的作用尚未见报道,因此, 我们将外源性基因R GS16 导入C6 细胞, 观察其对细胞的影响, 为确定R GS16 蛋白的功能和其在C6 细胞信号转导中的作用提供依据.059 第四军医大学学报 (J Fou rth M ilM ed U niv) 2002; 23 (10)1　材料和方法1. 1 　材料　大鼠胶质瘤细胞 C6: 本室保存;pCM V 52R GS16, pCM V 5 和 R GS16 抗体: 新加坡国立大学林圣彩教授惠赠; 脂质体: Gibco 公司; 3H 2T dR: 上海原子能研究所; 免疫组化试剂盒: 武汉博士德公司; DNA 2P rep 试剂盒: 美国Cou lter 公司.1. 2　方法1. 2. 1　基因转染[ 8 ]　C6 细胞在含 150 mL ·L - 1小牛血清的 R PM I1640 培养液中常规培养, 细胞生长至对数期时以 1×105ö孔接种于 6 孔培养板. 将pCM V 52R GS16 3 Λg 和脂质体 10 ΛL 分别溶于无血清培养液 100 ΛL , 两溶液缓慢混匀, 室温放置 30m in, 加入无血清培养液 0. 8 mL , 混匀后加入上述 6孔 培 养 板 中, 常 规 培 养 4 h 后, 每 孔 加 入 含150 mL ·L - 1小牛血清的 R PM I1640 培养液 2 mL.同样方法转染 pCM V 5 作为对照. 只加脂质体每孔10 ΛL 和未处理组各 3 孔作为阴性对照. 阳性率计算: 在随机一显微镜视野下, 阳性率 = R GS16 蛋白表达阳性的细胞数×100% ö总细胞数. 转染 24 h 后分别在倒置显微镜下观察细胞的形态变化.1. 2. 2　3H 2T dR 掺入法[ 9 ]　取对数生长期细胞, 消化后制成 1×109·L - 1细胞悬液, 按每孔 100 ΛL 接种于 96 孔培养板, 培养 4 h, 细胞贴壁. 将 pCM V 52R GS16 和 pCM V 5 质粒分别按 4 组不同梯度 (90,180, 270, 360 ngö孔) , 与 0. 8 ΛL 脂质体分别溶于 25ΛL 无血清培养液, 每个梯度 3 孔, 两溶液缓慢混匀,室温放置 30 m in, 混匀后加入上述已接种细胞的 96孔培养板中, 24 h 后每孔加3H 2T dR 1. 85×104 Bq(50 ΛL ) , 继续培养 12 h, 吸取上清液, PBS 洗涤 3 次后测3H 2T dR 掺入率.1. 2. 3　免疫细胞化学染色　转染同时制备细胞爬片, 转染后 36 h 取出, PBS 洗涤 2 次×3 m in; 950mL ·L - 1乙醇固定 30 m in, 加兔抗鼠 R GS16 抗体(1∶50) , 4℃ 过夜, PBS 洗涤 3 次×5 m in; 加入即用型羊抗兔, 室温放置 30 m in, PBS 洗涤 3 次×5 m in;加入 SABC 复合物, 室温放置 30 m in, PBS 洗涤 3 次×5 m in; DAB 显色, 苏木精衬染.1. 2. 4　细胞周期和凋亡分析　36 h 后取 4 组细胞各约 1×106 个, 经胰酶消化制成单细胞悬液, 离心 2次, 每次 PBS 4 mL 洗涤. 700 mL ·L - 1乙醇固定,DNA 染色后用流式细胞仪检测细胞周期变化和是否有凋亡峰出现.统计学处理: 采用 t 检验进行统计学分析.2　结果2. 1　细胞形态变化　转染 pCM V 52R GS16 24 h 后,倒置显微镜下显示细胞贴壁性降低, 突起收缩, 细胞变圆. 对照组未见明显变化 (F ig 1).2. 2　3H-TdR 掺入法　转染 pCM V 52R GS16 组放射值随转染质粒 DNA 量的增加而明显升高. 转染pCM V 5 组放射值变化不明显. 统计表明两组之间有显著差异 (P < 0. 01, T ab 1).表 1　pCM V 52R GS16 组和 pCM V 5 组不同梯度的3H 2T dR 值T ab 1　3H 2T dR values of pCM V 52R GS16 group and pCM V 5group (n= 3, xθ±s)Group 90ng 180ng 270ng 360ngPCM V 5 740±13 690±42 780±14 709±29PCM V 52RGS16b 733±12 899±32 1037±26 1209±19bP < 0. 01 vs pCM V 5.2. 3 　免疫细胞化学　转染 pCM V 52R GS16 组R GS16 蛋白表达阳性 (阳性率 13% , F ig 2) ; 转染pCM V 5 组脂、质体组和未处理组 R GS16 蛋白表达阴性.图 1　转染 pCM V 52R GS16 24 h 后C6 细胞形态变化F ig 1　M o rpho logical and adhesive changes of the cells 24 hafter transfect ion of pCM V 52R GS16　×100图 2　转染 pCM V 52R GS16 36 h 后C6 细胞R GS16 蛋白表达阳性F ig 2 　 Exp ression of R GS16 in C6 cells 36 h aftertransfect ion of pCM V 52R GS16　SABC　×100159第四军医大学学报 (J Fou rth M ilM ed U niv) 2002; 23 (10)2. 4　细胞周期和凋亡分析　转染 pCM V 52R GS16组细胞周期 G1 期细胞比例减少, S 期增多. pCM V 5组、脂质体组和未处理组细胞周期变化不明显 (T ab2). 未发现有凋亡峰出现.表 2　流式细胞仪检测各组细胞周期T ab 2　Cell cycle assay by cytom etryGroup G1 S G2N o rm al 0. 70 0. 21 0. 09L ipofectin 0. 73 0. 19 0. 08PCM V 5 0. 73 0. 18 0. 09PCM V 52RGS16 0. 60 0. 35 0. 053　讨论R GS 蛋白家族是一组含有约 120 个氨基酸在进化上很保守的R GS 结构域的蛋白质. 它们主要直接与 G 蛋白的 GΑi 和 GΑq 亚基结合, 通过上调 G 蛋白Α亚基的 GT P 酶活性, 促进 G 蛋白 Α亚基和 ΒΧ亚基的结合, 从而负调节 G 蛋白的活性, 并间接负调节 G蛋白对M A PK 的激活[ 2 ]. 1997 年我们[ 3 ]在小鼠垂体克隆了 R GS16 并发现其可以代替酵母细胞中一种R GS 蛋白 SST 2 的功能, 使停滞于 G1 期的酵母细胞恢复增殖状态. 后来我们[ 4 ]又发现R GS16 可以减弱血小板激活因子对 p 38M A PK 的激活作用; 并且在CEM 细胞中蛋白激酶C 可以通过上调 TN F2Α而诱导 R GS16 的表达[ 5 ]. Buckb inder 等[ 6 ] 和 Beadling等[ 7 ]曾分别发现 p 53 和 IL 22 也可以诱导 R GS16 的表达. 因此我们推测R GS16 可能参与细胞的凋亡和应激反应 . 我们将pCM V 52R GS16 转入C6 细胞后,发现细胞贴壁性降低, 星状突起收缩, 细胞变圆; 36 h后 R GS16 蛋白表达阳性; 3H 2T dR 掺入法结果显示R SG16 明显促进C6 细胞的增殖; 流式细胞仪结果表明 R GS16 促进了 G1 期的细胞加快向 S 期过渡, 使G1 期细胞百分数下降而 S 期细胞百分数增加; 但实验结果未发现R GS16 与凋亡的直接关系.本研究表明, R GS16 可以促进胶质瘤C6 细胞的增殖, 有类似 SST 2 在酵母细胞中的作用[ 3 ]. 由于SST 2 通过下调G 蛋白活性从而减弱主要通过RA SöRA FöM A PK 通路传递到细胞核内的信号, 使C ln1p 2Cdc28 和C ln2p 2Cdc28 活化, 促进细胞增殖[ 10 ]. 因此我们推测R GS16 也可能通过间接调节Cdc28 而调节C6 细胞周期的运行. 但由于哺乳动物细胞信号转导的复杂性以及胶质瘤 C6 细胞内基因突变造成信号转导通路与正常细胞之间的差异性[ 11 ] , 因此也不能排除R GS16 通过其他信号转导通路调节C6 细胞周期的运行. 由于本实验未发现 R GS16 与凋亡的关系, 因此R GS16 与p 53, p 38M A PK, TN F2Α以及 IL 22 之间的关系在细胞增殖和凋亡中的作用还有待于进一步探索.参考文献:[ 1 ] Guderm ann T , Gro sse R , Schultz G. Contribu tin of recep to röG2p ro tein signaling to cell grow th and transfo rm ation [ J ].N auny n S chm ied eberg s A rch P harm acol, 2000; 361 ( 1 ) :345- 362.[ 2 ] Burchett SA. Regulato rs of G p ro tein signaling: A bestiary ofmodular p ro tein b inding dom ains [ J ]. J N eu rochem , 2000;75 (4) : 1335- 1351.[ 3 ] Chen C, Zheng B, H an J , L in SC. Characterization of a novelm amm alian RGS p ro tein that b inds to galpha p ro teins andinh ib its pheromone signaling in yeast [J ]. J B iol Chem , 1997;272 (13) : 8679- 8685.[ 4 ] Zhang Y, N eo SY, H an J , Yaw L P, L in SC. RGS16 attenuatesgalphaq2dependent p38 m itogen2activated p ro tein k inaseactivation by p latelet2activating facto r [J ]. J B iol Chem , 1999;274 (5) : 2851- 2857.[ 5 ] Tong CW , Zhang Y, N eo SY, L in SC. Specific induction ofRGS16 ( regulato r of G2p ro tein signaling 16) mRNA by p ro teink inase C in CEM leukaem ia cells is m ediated via tumo r necro sisfacto r Α in calcium 2sensit ive m anner [ J ]. B iochem J , 2000;352 (3) : 747- 753.[ 6 ] Buckbinder L , M igul SV , Chen Y, Xu N Z, T alo tt t R , GelbertL , Gao J , Seizinger BR , Gutk ind JS, Kly N. T he p53 tumo rsupp resso r targets a novel regu lato r of G p ro tein signaling [J ].P roc N atl A cad S ci U SA , 1997; 94 (15) : 7868- 7872.[7 ] Beadling C, D ruey KM , R ich ter G, Keh rl JH , Sm ith KA.Regulato rs of G p ro tein signaling exh ib it dist inct patterns ofgene exp ression and target G p ro tein specificity in hum anlymphocytes [J ]. J Imm unol, 1999; 162 (5) : 2677- 2682.[8 ] Pan Y, H uang W , A i YF. In teraction of p ro liferation betw eenvascu lar endo thelial cell and smoo th m uscle cell of rabb its inv itro [J ]. D i2si J uny i D ax ue X uebao (J F ou rth M il M ed U niv ) ,2001; 22 (1) : 12- 15.[ 9 ] Zhang BC, L iQ , Ye J , W ang YM. p38M A PK gene transfectioncan induce the apop to sis of gliom a cells C6 [ J ]. D i2si J uny iD ax ue X uebao ( J F ou rth M il M ed U niv ) , 2001; 22 ( 3 ) :211- 213.[ 10 ] Chen T , Kurjan J. Saccharom yces cerevisiae. 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·研究原著· 文章编号: 100022790 (2002) 1020950203过度表达 G 蛋白调节子 16 促进大鼠胶质瘤C6 细胞增殖张　丰1, 李　青1, 章必成1, 叶　菁1, 陈广生1, 王　莉1, 林圣彩2(1 第四军医大学西京医院病理科, 陕西 西安 710033; 2 新加坡国立大学分子细胞生物学研究所, 新加坡 117609)关键词: 调节子; G 蛋白; 转染; 细胞周期中图号: R 739. 41　　　文献标识码: A摘　要: 目的　探讨 G 蛋白调节子 16 (R GS16)对大鼠胶质瘤C6 细胞的生物学特性的影响. 方法　利用脂质体介导法将R GS16 基因导入C6 细胞中, 在倒置显微镜下观察细胞形态变化和贴壁情况; 3H 2T dR 法检测 C6 细胞在转染不同梯度pCM V 52R GS16 和 pCM V 5 质粒后的增殖情况; 免疫细胞化学法检测转染前后R GS16 蛋白的表达情况; 流式细胞仪检测转染pCM V 52R GS16 和pCM V 5 质粒 36 h 后细胞周期变化和细胞是否有凋亡发生. 结果　转染 pCM V 52R GS16 质粒 24 h后 30% 细胞贴壁性降低, 突起收缩, 细胞变圆; R GS16 蛋白表达阳性; 3H 2T dR 法检测显示 C6 细胞增殖速度与转染pCM V 52R GS16 的量呈正相关; 细胞周期结果显示 G1 期细胞百分数减少 10% , 而 S 期细胞百分数增多 14% ; 未发现R GS16 与凋亡有直接关系. 结论　R GS16 可能促进C6 细胞的增殖.Prom otion of gl ioma C6 cells prol ifera tion byoverexpressed RGS16ZH A N G F eng1, L I Q ing 1, ZH A N G B i2Cheng 1,Y E J ing1, CH EN Guang 2S heng 1, W A N G L i1,L IN S heng 2Ca i21D epartm en t of Pa tho logy, X ijing Ho sp ita l, Fou rthM ilita ry M edica l U n iversity, X i’an 710033, Ch ina,2 In st itu te of M o lecu lar & Cell B io logy, N at iona lU n iversity of Singapo re, Singapo re 117609Keywords: regu lon; G2p ro tein s; t ransfect ion; cell cycle收稿日期: 2001211220; 　修回日期: 2001212220基金项目: 高等学校骨干教师计划资助通讯作者: 李　青. T el. ( 029 ) 3376957 　 Em ail. L iqing @fmm u.edu. cn作者简介: 张　丰 (19752) , 男 (汉族) , 山西省稷山县人. 硕士生 (导师李青). T el. (029) 3374541 Ext. 119　Em ail. cyp ress1975@ 263.netAbstracts: A IM 　 To study the effect of R GS16 on theb io logical characterist ics of gliom a C6 cells. M ETHOD S　pCM V 52R GS16 w as transfected in to C6 cells by lipofect in.T he mo rpho logical and adhesive changes of the cells w ereobserved under an inverted m icro scope. P ro liferat ion of C6cells w as m easu red by 3H 2thym idine ( 3H 2T dR ) assay aftergradien t transfect ions of pCM V 52R GS16 and pCM V 5.Exp ression of R GS16 w as exam ined by imm unocytochem icalm ethod bo th befo re and after the transfect ion. F lowcytom etry w as adop ted to m easu re changes in the fract ionnum ber of the cell cycle phase and to detect w hether R GS16cou ld induce apop to sis of C6 cell. RESUL TS　24 hours afterthe transfect ion of pCM V 52R GS16 app rox im ately 30% of C6cells grew round and 13% exp ressed R GS16; 36 h later thepo sit ive relat ionsh ip betw een the p ro liferat ion of C6 cells andthe gradien t transfect ions of pCM V 52R GS16 w as disp layed by3H 2T dR assay. F low cytom etry show ed that the fract ionnum ber of G1 phase of C6 cells reduced by 10% and that of Sphase accum ulated by 14% and R GS16 cou ld no t induceapop to sis of C6 cells. CONCL USION 　 R GS16 m igh tp romo te the p ro liferat ion of C6 cells.0　引言G 蛋白在丝裂原激活蛋白激酶 (m itogen2act iva ted p ro tein k inases, M A PK) 引起细胞增殖和分化的信号转导过程中起重要调控作用[ 1 ]. G 蛋白调节子 ( regu la to rs of G p ro tein signa ling, R GS) 是近年来新发现的参与 G 蛋白信号转导的一个大家族, 主要功能是负调节 GΑi 和 GΑq 亚基, 其成员超过20 种[ 2 ]. 1997 年我们[ 3 ] 在小鼠垂体内克隆了R GS16, 并发现其在肝、垂体和脑组织内表达丰富.最近发现R GS16 可能参与细胞的应激反应[ 4- 7 ]. 根据文献检索 R GS16 在胶质瘤中的作用尚未见报道,因此, 我们将外源性基因R GS16 导入C6 细胞, 观察其对细胞的影响, 为确定 R GS16 蛋白的功能和其在C6 细胞信号转导中的作用提供依据.059 第四军医大学学报 (J Fou rth M ilM ed U niv) 2002; 23 (10)1　材料和方法1. 1 　材料　大鼠胶质瘤细胞 C6: 本室保存;pCM V 52R GS16, pCM V 5 和 R GS16 抗体: 新加坡国立大学林圣彩教授惠赠; 脂质体: Gibco 公司; 3H 2T dR: 上海原子能研究所; 免疫组化试剂盒: 武汉博士德公司; DNA 2P rep 试剂盒: 美国Cou lter 公司.1. 2　方法1. 2. 1　基因转染[ 8 ]　C6 细胞在含 150 mL ·L - 1小牛血清的 R PM I1640 培养液中常规培养, 细胞生长至对数期时以 1×105ö孔接种于 6 孔培养板. 将pCM V 52R GS16 3 Λg 和脂质体 10 ΛL 分别溶于无血清培养液 100 ΛL , 两溶液缓慢混匀, 室温放置 30m in, 加入无血清培养液 0. 8 mL , 混匀后加入上述 6孔 培 养 板 中, 常 规 培 养 4 h 后, 每 孔 加 入 含150 mL ·L - 1小牛血清的 R PM I1640 培养液 2 mL.同样方法转染 pCM V 5 作为对照. 只加脂质体每孔10 ΛL 和未处理组各 3 孔作为阴性对照. 阳性率计算: 在随机一显微镜视野下, 阳性率 = R GS16 蛋白表达阳性的细胞数×100% ö总细胞数. 转染 24 h 后分别在倒置显微镜下观察细胞的形态变化.1. 2. 2　3H 2T dR 掺入法[ 9 ]　取对数生长期细胞, 消化后制成 1×109·L - 1细胞悬液, 按每孔 100 ΛL 接种于 96 孔培养板, 培养 4 h, 细胞贴壁. 将 pCM V 52R GS16 和 pCM V 5 质粒分别按 4 组不同梯度 (90,180, 270, 360 ngö孔) , 与 0. 8 ΛL 脂质体分别溶于 25ΛL 无血清培养液, 每个梯度 3 孔, 两溶液缓慢混匀,室温放置 30 m in, 混匀后加入上述已接种细胞的 96孔培养板中, 24 h 后每孔加3H 2T dR 1. 85×104 Bq(50 ΛL ) , 继续培养 12 h, 吸取上清液, PBS 洗涤 3 次后测3H 2T dR 掺入率.1. 2. 3　免疫细胞化学染色　转染同时制备细胞爬片, 转染后 36 h 取出, PBS 洗涤 2 次×3 m in; 950mL ·L - 1乙醇固定 30 m in, 加兔抗鼠 R GS16 抗体(1∶50) , 4℃ 过夜, PBS 洗涤 3 次×5 m in; 加入即用型羊抗兔, 室温放置 30 m in, PBS 洗涤 3 次×5 m in;加入 SABC 复合物, 室温放置 30 m in, PBS 洗涤 3 次×5 m in; DAB 显色, 苏木精衬染.1. 2. 4　细胞周期和凋亡分析　36 h 后取 4 组细胞各约 1×106 个, 经胰酶消化制成单细胞悬液, 离心 2次, 每次 PBS 4 mL 洗涤. 700 mL ·L - 1乙醇固定,DNA 染色后用流式细胞仪检测细胞周期变化和是否有凋亡峰出现.统计学处理: 采用 t 检验进行统计学分析.2　结果2. 1　细胞形态变化　转染 pCM V 52R GS16 24 h 后,倒置显微镜下显示细胞贴壁性降低, 突起收缩, 细胞变圆. 对照组未见明显变化 (F ig 1).2. 2　3H-TdR 掺入法　转染 pCM V 52R GS16 组放射值随转染质粒 DNA 量的增加而明显升高. 转染pCM V 5 组放射值变化不明显. 统计表明两组之间有显著差异 (P < 0. 01, T ab 1).表 1　pCM V 52R GS16 组和 pCM V 5 组不同梯度的3H 2T dR 值T ab 1　3H 2T dR values of pCM V 52R GS16 group and pCM V 5group (n= 3, xθ±s)Group 90ng 180ng 270ng 360ngPCM V 5 740±13 690±42 780±14 709±29PCM V 52RGS16b 733±12 899±32 1037±26 1209±19bP < 0. 01 vs pCM V 5.2. 3 　免疫细胞化学　转染 pCM V 52R GS16 组R GS16 蛋白表达阳性 (阳性率 13% , F ig 2) ; 转染pCM V 5 组脂、质体组和未处理组 R GS16 蛋白表达阴性.图 1　转染 pCM V 52R GS16 24 h 后C6 细胞形态变化F ig 1　M o rpho logical and adhesive changes of the cells 24 hafter transfect ion of pCM V 52R GS16　×100图 2　转染 pCM V 52R GS16 36 h 后C6 细胞R GS16 蛋白表达阳性F ig 2 　 Exp ression of R GS16 in C6 cells 36 h aftertransfect ion of pCM V 52R GS16　SABC　×100159第四军医大学学报 (J Fou rth M ilM ed U niv) 2002; 23 (10)2. 4　细胞周期和凋亡分析　转染 pCM V 52R GS16组细胞周期 G1 期细胞比例减少, S 期增多. pCM V 5组、脂质体组和未处理组细胞周期变化不明显 (T ab2). 未发现有凋亡峰出现.表 2　流式细胞仪检测各组细胞周期T ab 2　Cell cycle assay by cytom etryGroup G1 S G2N o rm al 0. 70 0. 21 0. 09L ipofectin 0. 73 0. 19 0. 08PCM V 5 0. 73 0. 18 0. 09PCM V 52RGS16 0. 60 0. 35 0. 053　讨论R GS 蛋白家族是一组含有约 120 个氨基酸在进化上很保守的R GS 结构域的蛋白质. 它们主要直接与 G 蛋白的 GΑi 和 GΑq 亚基结合, 通过上调 G 蛋白Α亚基的 GT P 酶活性, 促进 G 蛋白 Α亚基和 ΒΧ亚基的结合, 从而负调节 G 蛋白的活性, 并间接负调节 G蛋白对M A PK 的激活[ 2 ]. 1997 年我们[ 3 ]在小鼠垂体克隆了 R GS16 并发现其可以代替酵母细胞中一种R GS 蛋白 SST 2 的功能, 使停滞于 G1 期的酵母细胞恢复增殖状态. 后来我们[ 4 ]又发现 R GS16 可以减弱血小板激活因子对 p 38M A PK 的激活作用; 并且在CEM 细胞中蛋白激酶 C 可以通过上调 TN F2Α而诱导 R GS16 的表达[ 5 ]. Buckb inder 等[ 6 ] 和 Beadling等[ 7 ]曾分别发现 p 53 和 IL 22 也可以诱导 R GS16 的表达. 因此我们推测R GS16 可能参与细胞的凋亡和应激反应 . 我们将pCM V 52R GS16 转入C6 细胞后,发现细胞贴壁性降低, 星状突起收缩, 细胞变圆; 36 h后 R GS16 蛋白表达阳性; 3H 2T dR 掺入法结果显示R SG16 明显促进C6 细胞的增殖; 流式细胞仪结果表明 R GS16 促进了 G1 期的细胞加快向 S 期过渡, 使G1 期细胞百分数下降而 S 期细胞百分数增加; 但实验结果未发现R GS16 与凋亡的直接关系.本研究表明, R GS16 可以促进胶质瘤C6 细胞的增殖, 有类似 SST 2 在酵母细胞中的作用[ 3 ]. 由于SST 2 通过下调G 蛋白活性从而减弱主要通过RA SöRA FöM A PK 通路传递到细胞核内的信号, 使C ln1p 2Cdc28 和C ln2p 2Cdc28 活化, 促进细胞增殖[ 10 ]. 因此我们推测R GS16 也可能通过间接调节Cdc28 而调节C6 细胞周期的运行. 但由于哺乳动物细胞信号转导的复杂性以及胶质瘤 C6 细胞内基因突变造成信号转导通路与正常细胞之间的差异性[ 11 ] , 因此也不能排除R GS16 通过其他信号转导通路调节C6 细胞周期的运行. 由于本实验未发现 R GS16 与凋亡的关系, 因此R GS16 与p 53, p 38M A PK, TN F2Α以及 IL 22 之间的关系在细胞增殖和凋亡中的作用还有待于进一步探索.参考文献:[ 1 ] Guderm ann T , Gro sse R , Schultz G. Contribu tin of recep to röG2p ro tein signaling to cell grow th and transfo rm ation [ J ].N auny n S chm ied eberg s A rch P harm acol, 2000; 361 ( 1 ) :345- 362.[ 2 ] Burchett SA. 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http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/6022/%e8%bf%87%e5%ba%a6%e8%a1%a8%e8%be%beG%e8%9b%8b%e7%99%bd%e8%b0%83%e8%8a%82%e5%ad%9016%e4%bf%83%e8%bf%9b%e5%a4%a7%e9%bc%a0%e8%83%b6%e8%b4%a8%e7%98%a4C6%e7%bb%86%e8%83%9e%e5%a2%9e%e6%ae%96.pdf?sequence=1&isAllowed=y

Promotion of glioma C6 cells proliferation by overexpressed RGS16

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