Corresponding author. Email: jzzhou@xmu.edu.cn; Tel: +86-592-2189663.[中文文摘]金纳米粒子(AuNPs)的颜色会随着细胞色素c(Cytc)构象变化而发生较大的变化,作者在改变原测定流程的基础上利用这种有规律的变化研究和测定了H+和L-半胱氨酸(L-Cys)对Cytc的构象变化.实验中分别加入pH=1-13的Cytc,可以使AuNPs显示青、蓝、紫、红等明显不同的颜色,从而可以利用AuNPs比色快速测定不同pH值的Cytc构象变化.在pH=7时,当附加L-Cys浓度从低浓度变化到高浓度时,AuNPs颜色逐渐从紫色变化到蓝色、青色,从而实现利用AuNPs比色测定由L-Cys所引起Cytc构象变化.圆二色(CD)光谱证实了pH=1-13和不同浓度L-Cys下的Cytc构象变化.借助紫外-可见吸收光谱和扫描电子显微镜(SEM)进一步明确了加入Cytc后AuNPs的不同聚集状态与其颜色变化的关系.[英文文摘]The colors of Au nanoparticles(Au NPs) change along with conformational changes in cytochrome c(Cyt c).We exploited this property for the colorimetric detection of Cyt c conformational changes induced by H + and L-cysteine(L-Cys).We improved the conventional procedure for this detection.After the addition of Cyt c within different pH values,the Au NPs are either cyan,blue,purple or red.This indicates that the Au NPs can be applied to the rapid colorimetric detection of pH-induced conformational changes in Cyt c conformational changes caused by interaction with L-Cys. The conformational changes
of Cyt c were verified by circular dichroism (CD) spectroscopy. The relationship between the aggregation states and
colors of the Au NPs after the addition of Cyt c was characterized by UV-Vis absorption spectroscopy and scanning electron microscopy (SEM).国家自然科学基金(20603027,20423002)资助项

周剑章

林仲华

林玲玲

栗娜

韩楠楠

Acta Physico-Chimica Sinica

Xiamen University Institutional Repository

[Article] www.whxb.pku.edu.cn物理化学学报(Wuli Huaxue Xuebao)Acta Phys. -Chim. Sin., 2010, 26(9)：2468-2472 SeptemberReceived: March 8, 2010; Revised: April 22, 2010; Published on Web: July 16, 2010.*Corresponding author. Email: jzzhou@xmu.edu.cn; Tel: +86-592-2189663.The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (20603027, 20423002).国家自然科学基金(20603027, 20423002)资助项目鬁 Editorial office of Acta Physico-Chimica Sinica金纳米粒子比色测定细胞色素 c 构象变化栗 娜 周剑章* 林玲玲 韩楠楠 林仲华(厦门大学化学化工学院化学系, 固体表面物理化学国家重点实验室, 福建 厦门 361005)摘要： 金纳米粒子(Au NPs)的颜色会随着细胞色素 c (Cyt c)构象变化而发生较大的变化, 作者在改变原测定流程的基础上利用这种有规律的变化研究和测定了 H+和 L-半胱氨酸(L-Cys)对 Cyt c 的构象变化. 实验中分别加入 pH=1-13 的 Cyt c, 可以使 Au NPs 显示青、蓝、紫、红等明显不同的颜色, 从而可以利用 Au NPs 比色快速测定不同 pH 值的 Cyt c 构象变化. 在 pH=7 时, 当附加 L-Cys 浓度从低浓度变化到高浓度时, Au NPs 颜色逐渐从紫色变化到蓝色、青色, 从而实现利用 Au NPs 比色测定由 L-Cys 所引起 Cyt c 构象变化. 圆二色(CD)光谱证实了pH=1-13 和不同浓度 L-Cys 下的 Cyt c 构象变化. 借助紫外-可见吸收光谱和扫描电子显微镜(SEM)进一步明确了加入 Cyt c 后 Au NPs 的不同聚集状态与其颜色变化的关系.关键词： Au 纳米粒子; 比色测定; Cyt c 构象变化; pH 值; L-Cys中图分类号： O648Au Nanoparticles Based Colorimetric Detection ofConformational Changes in Cytochrome cLI Na ZHOU Jian-Zhang* LIN Ling-Ling HAN Nan-Nan LIN Zhong-Hua(Key Laboratory of Physical Chemistry of Solid Surface, Department of Chemistry, College of Chemistry andChemistry Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, Fujian Province, P. R. China)Abstract： The colors of Au nanoparticles (Au NPs) change along with conformational changes in cytochrome c (Cyt c).We exploited this property for the colorimetric detection of Cyt c conformational changes induced by H + and L-cysteine (L-Cys). We improved the conventional procedure for this detection. After the addition of Cyt c withindifferent pH values, the Au NPs are either cyan, blue, purple or red. This indicates that the Au NPs can be applied tothe rapid colorimetric detection of pH-induced conformational changes in Cyt c. At pH 7 the color of Au NPs changesfrom purple to blue and then cyan upon the addition of L-Cys, which suggests that the Au NPs can be used for thecolorimetric detection of Cyt c conformational changes caused by interaction with L-Cys. The conformational changesof Cyt c were verified by circular dichroism (CD) spectroscopy. The relationship between the aggregation states andcolors of the Au NPs after the addition of Cyt c was characterized by UV-Vis absorption spectroscopy and scanningelectron microscopy (SEM).Key Words： Au nanoparticle; Colorimetric detection; Conformational changes of Cyt c; pH value; L-Cys自从 1996 年 Mirkin 等 [1]首次构筑了脱氧核糖核酸(DNA)-金纳米粒子(Au NPs)生物纳米复合体系以来, 近年利用 Au NPs 作为光学生物传感器成为研究热点[2-4]. 鉴于其不同聚集状态时颜色不同, AuNPs 比色测定已经广泛应用在金属离子[5-7]、DNA[8-9]、酶 [10-12]、蛋白质 [13-14]的检测和作用原理研究中. 细胞色素 c (Cyt c)是中心为血红素结构的低分子量蛋白,在细胞呼吸链中担负着传递电子的重要作用. 在不2468No.9 栗 娜等：金纳米粒子比色测定细胞色素 c 构象变化同条件(如 pH 值、温度及氧化还原性物质共存)下,Cyt c 有着不同的构象 [15]. 研究 Cyt c 的构象变化对于理解其构象和其在生物分子中的功能之间的关系有着至关重要的作用. Zare 等[16]利用 Au NPs 比色测定了不同 pH 时酵母菌细胞色素 c (Cyt c)的构象变化, 这也是第一次利用 Au NPs 比色测定蛋白质的构象变化. 而 Francoet 等 [17] 分别研究了酵母菌和马心 Cyt c 在Cyt c-Au NPs 复合体系中的表面性质.然而， 之前的研究需要先制备稳定的 Cyt c-AuNPs 复合体系(要过夜)，再调节复合体系 pH 值[16-17].作为一种检测方法而言， 这样的操作过程还是比较繁琐、耗时. 我们利用蛋白质构象变化延迟性的特点[18], 改变了测定流程. 先将Cyt c调节到各个pH值,后加入到 Au NPs 中, 虽然加入 Au NPs 后体系的最终 pH 值会改变 , 但是 Cyt c 构 象 短 时 间 内 变 化 很小. 由此得到了一种利用 Au NPs 更简单, 更快速(1min 内变色), pH 值范围更广泛(pH 为 1-13, 之前pH为 4-11), 颜 色 变 化 更 多 样 的 检 测 H+引 起 的 马 心Cyt c 构象变化的方法. 接着, 我们又利用 Au NPs 比色成功测定了在 pH=7 的条件下由 L-半胱氨酸(L-Cys)引起的马心 Cyt c 构象变化.1 实验部分1.1 试剂与仪器氯金酸 HAuCl4·4H2O 和柠檬酸三钠Na3C6H5O·2H2O 购自北京化学制药厂, 分析纯; L-半胱氨酸(L-Cys)盐酸盐 C3H8ClNO2S 购自吉尔生化有限公司, 分析纯; 三羟甲基氨基甲烷(Tris)氢氧化钠、浓盐酸、氯化钠均购自国药集团分析试剂有限 公 司 , 分 析 纯 ;马心细胞色素 c (Cyt c 氧化型)购自 Sigma ChemicalCo., 分 析 纯 , 未 经 任 何 处 理 , 溶 解 在 缓 冲 溶 液 (10mmol·L-1 Tris +10 m mol·L-1 NaCl, pH=7)中以制备500 mg·L-1 储备液 . 0.1 mol·L-1 L-Cys 储备液的制备 是 将 适 量 的 L-Cys 盐 酸 盐 加 入 缓 冲 溶 液 中 , 用NaOH 调 节 至 pH=7. 实 验 用 水 为 去 离 子 超 纯 水(Milli-Q, Millipore).照片由日本佳能 IXUS 970 IS 型数码相机拍摄,pH 值由美国奥立龙 828 精密型酸度计测量得到. 紫外-可 见 (UV-Vis)吸 收 光 谱 由 日 本 岛 津 公 司 UV-2100 双池紫外-可见吸收光谱仪测量 , 以超纯水作为参比溶液. 圆二色(CD)光谱是由日本分光株式会社 J-810 圆二色谱仪测量 . 扫 描 电 子 显 微 镜(SEM)图是由日本日立公司 Hitachi S-4800 扫描电子显微镜测试得到. 所有实验测试均在常温下进行.1.2 实验过程Au NPs的制备: 利用文献方法[19]合成, 在250 mL锥形瓶中分别加入 150 mL 超纯水, 将 1.815 mL 质量分数为 1%的氯金酸溶液回流加热煮沸后 , 加入4.5 mL 质量分数为 1%的 柠檬酸三钠溶液回流加热至 变 为 浅 紫 色 后 继 续 回 流 加 热 50 min, 最 终 颜 色为鲜红色. 冷却至室温后, 存储在冰箱(4℃), 待用.H+引起的 Cyt c 构象变化的比色测定及表征 :首 先 用 缓 冲 液 稀 释 Cyt c 储 备 液 到 50 mg·L-1, 用HCl 和 NaOH 分别调节 pH 值到 1-6 和 7-13, 将制备好的样品进行 CD 光谱测试. 然后将 15 μL 不同pH 值的 Cyt c 加入 400 μL Au NPs 中, 迅速混匀后观察其颜色变化(1 min 之内变色)并拍照, 后直接用于 UV-Vis 吸 收 光 谱 检 测 . 滴 加 含 有 Cyt c 的 AuNPs 溶液到硅片上, 1 min 后, 用滤纸吸干, 并用超纯水洗净, 静置放干, 用于 SEM 图测试.L-Cys 引起的 Cyt c 构象变化的比色测定及表征: 首先利用 L-Cys 储备液和 Cyt c 储备液制备含L-Cys 的 Cyt c, 其中 Cyt c 浓度为 50 mg·L-1, 而 L-Cys 浓 度 分 别 为 0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.50mmol·L-1, 用 于 CD 光 谱 测 试 . 将 15 μL 不 同 浓 度L-Cys 的 Cyt c 加 入 400 μL Au NPs 中 , 迅 速 混 匀 ,观察其颜色 变 化 并 拍 照 . 同 上 处 理 后 用 于 UV-Vis吸收光谱和 SEM 测试.2 结果与讨论2.1 Au NPs 的制备与表征图 1 的内插图 A 为 Au NPs 的 SEM 图, 可看出所制备 Au NPs 呈规则的球形, 分散性很好. 图 1 中UV-Vis 吸 收 光 谱 图 表 明 其 最 大 吸 收 峰 在 521 nm处 , 特征吸收峰尖锐 . 所制备的 Au NPs 颜 色 鲜 红 ,相当稳定(见图 1 内插图 B).2.2 Au NPs 比色测定不同 pH 值下 Cyt c 的构象变化图 2 展示了不同 pH 值下不含和含 Cyt c 的 AuNPs 的照片. 上面一列是在 Au NPs 中分别加入单纯缓冲液(pH 从 1 到 13)的照片, 可以看到 Au NPs 显示红色, 说明 Au NPs 在此酸碱性条件下很稳定, 这与文献的结果 [16]一致. 而下面一列是含 Cyt c 的 AuNPs 照片, 可以看到加入不同 pH 值的 Cyt c 后, AuNPs 逐渐显示从青色到蓝色 , 再到紫色 , 最后为 红色. Cyt c 的 pH=1 时, 呈现青色; pH=2 时, 呈现深蓝2469Acta Phys. -Chim. Sin., 2010 Vol.26色 ; pH=3-7, 呈 现 蓝 色 ; pH=8-10, 呈 现 紫 色 ; pH=11-13 时候, 呈现红色.这些不同颜色体现了Au NPs不同的聚集状态,蓝(青)色为深度聚集状态, 紫色为轻度聚集状态, 而红色则是分散状态 . 图3的SEM图展示了分别加入pH值 为1、4、7、11的Cyt c后Au NPs的 形 貌 . 由 图 可见: pH=1时, Au NPs聚集程度最强; pH=4, 7时, 聚集程度较弱; 而pH=11时, Au NPs则处于分散状态, 这与其相应的颜色变化保持着高度的一致性.图 4(A)是加入不同 pH 值的 Cyt c 后 Au NPs的UV-Vis 吸收光谱(由于溶液中 Cyt c 的最终浓度很低, 其 UV-Vis 吸收峰被 Au NPs 的吸收峰所掩盖).当加入 pH 值从 1 到 10 的 Cyt c 时, Au NPs 第二等离子共振吸收峰(金纳米粒子聚集后由于相邻粒子间的等离子共振偶合而出现相对 520 nm 红移的新的 等 离 子 共 振 吸 收 峰 )的 峰 位 对 应 的 波 长 逐 渐 从623 nm 减小到 577 nm, 而加入 pH 值从 11 到 13 的Cyt c 时, Au NPs 没有第二等离子共振吸收峰, 只有其 521 nm 处的特征吸收峰. 可以看出, pH=1-10 时,吸收峰峰位变化较大; 而 pH=11-13 时, 对应峰位波长基本不变 . 为了进一步比较 Au NPs 等离子共振吸收峰位与 pH 值的关系, 我们做了该峰位下波长与 pH 值的关系曲线(见图 4(A)的内插图). 可以看出, pH 从 1 到 10 变化时, 峰位波长随着 pH 值的变大而逐渐减小, 而 pH 从 11 到 13 时, 峰位变化很小,基本趋于不变. 这跟其颜色从 pH=1-10 显示聚集态的青、蓝、紫色, 而 pH=11-13 显示分散态的红色是很一致的.由于马心 Cyt c 主要是通过静电吸附在 Au NPs上[17], 所以当 Cyt c 的 pH 值低于其等电点(10-10.8)时, 带负电的 Au NPs 与带正电的 Cyt c 相互吸引 ,从而 Au NPs 呈现聚集状态, 表现出紫色或者蓝(青)色; 相反, 当 Cyt c 的 pH 高于其等电点时, 带负电的Au NPs 与 带 负 电 的 Cyt c 相 互 排 斥 , 从 而 Au NPs呈现分散状态, 表现为红色. 同时, 在不同 pH 值下,Cyt c 构象会发生变化. pH=0.42-2.5 时, Cyt c 的疏水 内 核 打 开 , 其 为 非 折 叠 蛋 白 ; pH=2.5-12.76 时 ,Cyt c 是折叠蛋白; 而高于 12.76 时为另一种非折叠蛋白[15]. 本实验中是先将 Cyt c 调节到各个 pH(模拟各实际情况)后加入到 Au NPs 中, 虽然加入 Au NPs后体系最终的 pH 值会改变, 但是 Cyt c 构象短时间内 变 化 很 小 . 我 们 的 CD 光 谱 实 验 证 实 , 加 入 Au图 1 Au 纳米粒子(NPs)的紫外-可见吸收光谱Fig.1 UV-Vis absorption spectrum of Aunanoparticles (NPs)Insets are SEM image (A) and the photo (B) of Au NPs.图 2 不含(上列)和含(下列)Cyt c 的 Au NPs 照片Fig.2 Photos of Au NPs without (upper) andwith (lower) Cyt cpH: 1-13图 3 含 pH 值分别为 1, 4, 7, 11 的 Cyt c 的 Au NPs 的 SEM 图Fig.3 SEM images of Au NPs with Cyt c for pH=1, 4, 7, 112470No.9 栗 娜等：金纳米粒子比色测定细胞色素 c 构象变化NPs 后, 在实验测试时间内, Cyt c 的构象基本保持不变 . 图 4(B)是 pH=1-13 Cyt c 的 CD 光 谱 , 其 中208 和 222 nm 两处负峰是 Cyt c 的 α 高螺旋结构特征峰[20]. 在 pH=3-12 时, 222 和 208 nm 处存在负峰,说明 Cyt c 的 α 螺旋结构保持 , Cyt c 为折叠 蛋 白 ;而 pH=1-2 以及 pH=13 时, 两个负峰消失, 此时 Cytc 处于两种不同结构的非折叠状态.当 Cyt c 为 pH＜2.5 (pH=2, 1)的非折叠蛋白构象时, Cyt c带正电, AuNPs 呈现深蓝色和青色; pH 低于其等电点(pH=3-10)的折叠蛋白构象时, Cyt c 也带正电 , Au NPs 呈现蓝色和紫色; pH 高于其等电点(pH=11-12)的折叠蛋白构象时, Cyt c 带负电, Au NPs 显示红色, 可见等电点前后变色尤其明显; 而 pH=13 的非折叠蛋白构象时, Cyt c 也带负电, Au NPs 也显示红色. 由此可见 , 我们可以利用 Au NPs 比色快速灵敏地测定 pH=1-13 时 Cyt c 的构象变化.2.3 Au NPs比色测定L-cys引起的Cyt c构象变化已有研究发现，Cyt c 电化学研究中所采用的有些促进剂(如碘离子 [21]、胱氨酸 [22])可能会与 Cyt c 表面的赖氨酸作用进而引起 Cyt c 分子的构象发生微小的变化. L-Cys 也是一种 Cyt c 电化学活性的促进剂, 同时 Cyt c 中血红素能以共价键与蛋白链中的L-Cys 相联[15], 而 L-Cys 与 Cyt c 相互作用是否也会引起 Cyt c 构象的变化尚未见报道 . 我们尝试通过Au NPs 比色测定与 L-Cys 相互作用后 Cyt c 构象可能出现的微小变化，并用 CD 光谱进行验证. 图 5(A)的插 图 是 含 不 同 浓 度 L-Cys 的 Cyt c 加 入 Au NPs中后的照片, 由图可见, 在无 L-Cys 时, Au NPs 为紫色; 低浓度 L-Cys 时, Au NPs 为深紫色、蓝色; 而高浓度L-Cys时, Au NPs为青色. 图5(A)是相应的 UV-Vis 吸收光谱, 可见, L-Cys 浓度逐渐增大时, Au NPs第二等离子共振吸收峰峰位逐渐从短波长(560 nm)图 4 含 Cyt c 的 Au NPs 的 UV-Vis 吸收光谱(A)和 Cyt c 的圆二色光谱(B)Fig.4 UV-Vis absorption spectra of Au NPs with Cyt c (A) and CD spectra of Cyt c (B)Inset: the plot between wavelengths at absorption peaks with different pH values. The arrowhead points pH values from 2 to 10.图 5 含 Cyt c 和 L-Cys 的 Au NPs 的 UV-Vis 吸收光谱(A)和含不同浓度 L-Cys 的 Cyt c 的 CD 光谱(B)Fig.5 UV-Vis absorption spectra of Au NPs with Cyt c and L-Cys (A) and CD spectra of Cyt cwithdifferent concentrations of L-Cys (B)Inset: photographs of Au NPs. From left to right, the concentrations of the L-Cys are 0.00, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.50 mmol·L-1, respectively.(A)2471Acta Phys. -Chim. Sin., 2010 Vol.26向长波长(664 nm)移动. 从图 5(B)对应不同浓度 L-Cys 时 Cyt c 的 CD 光谱中可见, 随着 L-Cys 浓度增加, 222 和 208 nm 处峰值逐渐增大, 据此可推测 Cytc 的 α 螺旋随之逐渐加强, 在不含 Cyt c 的对照实验中, 单纯 L-Cys 并不能引起 Au NPs 颜色变化. 所以外加 L-Cys 所引起的 Au NPs 的颜色变化及 UV-Vis吸收光谱的变化应来源于 Cyt c 的构象变化 . 我们认为, 外加 L-Cys 和原来 Cyt c 中蛋白链上的 L-Cys会竞争与血红素作用 , 这种竞争作用致使 Cyt c 发生上述构象变化 , 从而进一步导致 Au NPs 显色逐渐加深.3 结 论根据 Cyt c 构象变化能够引起 Au NPs 的聚集状态变化从而变色这一特性, 在改变原测定流程的基础上利用 Au NPs 比色测定了由 H+和 L-Cys 引起的 Cyt c 的构象变化. 加入 pH 值分别从 1 到 13 的Cyt c 可以导致 Au NPs 分别显示青、蓝、紫、红等颜色; 同时 pH=7 时, 当外加 L-Cys 从低浓度逐渐变化到 高 浓 度 引 起 Au NPs 颜 色 逐 渐 从 紫 色 变 化 到 蓝色、青色. CD 光谱证实了不同浓度 H+和 L-Cys 下Cyt c 的构象变化, 同时 UV-Vis 吸收光谱中第二等离子共振吸收峰的移动和 SEM 图进一步明确了加入不同构象的 Cyt c 后 Au NPs 聚集状态的变化. 结果表明, 可以利用 Au NPs 比色测定的方法简单、快速地检测其他离子或分子与 Cyt c 的相互作用所引起的 Cyt c 构象的变化.References1 Mirkin, C. A.; Letsinger, R. L.; Mucic, R. C.; Storhoff, J. J. 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Au Nanoparticles Based Colorimetric Detection of Conformational Changes in Cytochrome c

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