Chemico-physical and biological study of new bioactive molecules in solution

Abstract

La tesi di Dottorato è rivolta allo studio chimico-fisico e biologico del comportamento in soluzione di molecole bioattive, in particolare di nuovi vettori non-virali per gene delivery e di leganti inibitori di HIV-1 integrasi. La terapia genica è una modalità terapeutica che prevede un intervento diretto sull’origine della malattia genetica attraverso il delivery nella cellula e la conseguente espressione di DNA esogeno che codifica per il prodotto del gene mancante o difettoso. Questa terapia viene indicata come una promettente alternativa alle terapie convenzionali per patologie come cancro, fibrosi cistica, disordini neurologici e cardiovascolari. Il delivery cellulare di DNA è principalmente effettuato con l’uso di vettori. Per evitare i risvolti tossici legati all’uso di vettori virali, negli ultimi anni si è sviluppato l’uso di vettori non-virali, polimeri o lipidi cationici che condensano il DNA carico negativamente in un complesso con carica netta positiva, necessaria per consentire al materiale genico l’ingresso attraverso le membrane cellulari, dotate di carica negativa. Con l’intento di chiarire il più possibile le relazioni tra la struttura e le caratteristiche chimico-fisiche dei lipidi cationici, sono state effettuate ricerche su tensioattivi glucocationici monomerici (acetilati e disacetilati) e tensioattivi gemini dipiridinici. Le misure condotte sono state di tipo chimico-fisico (entalpie molari, volumi molari, compressibilità adiabatiche, tensione superficiale, calorimetria differenziale a scansione) e biologico (elettroforesi, saggi di trasfezione transiente, microscopia a forza atomica). Queste misure hanno messo in evidenza come sia possibile correlare la conformazione che questi tensioattivi assumono in soluzione con la loro efficienza di trasfezione. È stato anche approfondito lo studio dei processi di idratazione idrofobica, chiamata in causa riguardo alla micellizzazione di questi tensioattivi, mediante il modello termodinamico-statistico messo a punto dal gruppo di ricerca dove ho svolto il Dottorato. Infine, per caratterizzare meglio l’abilità di complessazione dei beta-dicheto acidi (una classe di inibitori dell’enzima HIV-1 integrasi), è stata studiata, attraverso titolazioni potenziometriche, la distribuzione in soluzione dei complessi formati tra due beta-dicheto acidi e gli ioni Ca(II) e Mn(II).This doctoral thesis concerns the chemico-physical and biological study of the solution behaviour of bioactive compounds, in particular non-viral vectors for gene delivery and HIV-1 integrase inhibitors. Gene therapy involves a direct approach on the cause of the genetic disease by the delivery and the following expression of exogenous DNA codifing for the product of the lacking or defective gene. This therapy is regarded as a promising alternative of conventional treatment for cancer, cystic fibrosis, neurological and cardiovascular disorders. The delivery of DNA is usually carried out by using vectors. In order to avoid toxicological issues related to viral vectors, in the last years the use of non-viral vectors has rapidly increased. Non-viral vectors are cationic polymers or lipids able to condense anionic DNA: the resulting complex is positively charged and allows DNA to enter the negatively charged cell membranes. With the aim of clarify the relationship between the structure and the chemico-physical features of cationic lipids, studies upon acetylated and disacetylated monomeric glucocationic surfactants and dipyridinc gemini surfactants have been carried out. Chemico-physical (molar enthalpies, molar volumes, adiabatic compressibilities, surface tension, differential scanning calorimetry) and biological (electrophoresis, transient transfection assays, atomic force microscopy) measurements have been performed. These measurements have emphasized that it is possible to relate the conformation assumed in solution by these surfactants and their trasfection efficiency. Hydrophobic hydration processes, involved in micellization of surfactants, has also been studied by using a thermodynamic-statistical model set up by our research group. Finally, in order to better characterize the complexation ability of beta-diketoacids (a class of HIV-1 integrase inhibitors), the solution distribution of complexes between beta-diketoacids and Ca(II) and Mn(II) ions has been investigated by potentiometric titrations