2010/2011The present thesis was developed for the characterization of the risk associated to palytoxins as seafood contaminants. To this aim, an integrated approach between in vitro and in vivo studies was chosen. Palytoxin and its analogues are known seafood contaminants that can accumulate in several edible species of shellfish, fish, crustaceans and echinoderms. Generally, primary symptoms associated to the ingestion of contaminated food involve the gastro-intestinal apparatus and later develop with the involvement of the muscular tissue. For a better comprehension of the mechanism of action of this family of biotoxins, the effects of PLTX have been studied on primary culture of mouse skeletal muscle cells. The myotoxic insult triggered by PLTX was described in detail with the definition of the cytotoxicity together with the description of the morphologic alterations and functional impairment caused by the toxin. Moreover, the influence of the ionic composition of the extracellular medium on the effects of the toxin was elucidated. Primary cultures of skeletal muscle cells, that presents in vitro many of the peculiarities of the adult muscle fiber, allowed the investigation of the membrane mechanisms that regulate the intracellular calcium increase triggered by the toxin. It was possible to discriminate the difference between calcium release from intracellular stores and the calcium entrance from extracellular compartment both elicited by the toxin, and to understand the importance of the latter in relation to the toxic event. Moreover, the involvement of the main membrane channels and transporters that may be related to the entrance of calcium was investigated and the crucial role of stretch-activated channels in the mechanism of toxicity was demonstrated. Once defined the crucial molecular mechanisms of action of PLTX, experiments were also performed with two of its analogue: the 42-hydroxyl-palytoxin and the ostreocin-D.
In parallel to in vitro studies, the effects of repeated oral administration of PLTX in mice were also investigated. In fact, in vitro studies are not sufficient for the complete comprehension of the real hazard associated to a food contaminant, since molecules once in contact with the body may undergo adsorption, distribution and metabolism before reaching the target tissue. Short-term (7 days) administration of the toxin revealed toxicity at all the doses tested and lethality was recorded in the treated animals already from the dose of 30 µg/kg. Histological analysis highlighted alterations in several tissues: severe inflammatory processes and even foci of necrosis were observed in lungs. Alteration of the muscular tissues was visible as fiber separation and degeneration in the heart and increased cellularity between fibers in skeletal muscle. Moreover, depletion of glycogen content of hepatocytes and moderate alterations of the spleen were also observed. Data collected in the present project revealed, for the first time, toxicity of PLTX at doses much lower than that currently used by European Food Safety Authority (EFSA) for the estimation of limit values for presence of these compounds in seafood. For this reason, these results are likely to have a considerable impact at regulatory level and to have crucial importance for the protection of the consumers.Il presente lavoro di tesi è stato sviluppato con lo scopo di caratterizzare il rischio associato alla presenza delle palitossine quali contaminanti dei prodotti ittici destinati ad uso alimentare. A tal fine, è stato scelto un approccio integrato tra studi in vitro e in vivo. La palitossina e i suoi analoghi sono noti contaminanti dei prodotti ittici e possono accumularsi in diverse specie edibili di molluschi, pesci, crostacei ed echinodermi. Generalmente, i primi sintomi associati all’ingestione di cibo contaminato coinvolgono l’apparato gastro-intestinale e poi si sviluppano con l’interessamento del tessuto muscolare. Per una migliore comprensione del meccanismo d’azione di questa famiglia di biotossine, gli effetti della PLTX sono stati studiati mediante colture primarie murine di cellule muscolari scheletriche. L’insulto miotossico indotto dalla PLTX è stato descritto nel dettaglio con la definizione della citotossicità assieme alla descrizione delle modifiche morfologiche e delle alterazioni funzionali causate dalla tossina. Inoltre, è stata caratterizzata l’influenza della composizione ionica dell’ambiente extracellulare negli effetti della tossina. Le colture primarie di cellule muscolari scheletriche, che presentano molte delle caratteristiche peculiari della fibra muscolare adulta, hanno permesso l’indagine dei meccanismi che regolano l’aumento intracellulare di calcio indotto dalla tossina. E’ stato possibile discriminare la differenza tra il rilascio di calcio dai depositi intracellulari e l’entrata di calcio dai compartimenti extracellulari, entrambi effetti indotti dalla tossina, e comprendere l’importanza del secondo meccanismo in relazione agli eventi tossici. E’ stato indagato il coinvolgimento dei canali e trasportatori di membrana in relazione all’ingresso di calcio ed è stato dimostrato il ruolo cruciale dei canali attivati da stiramento nel meccanismo di tossicità. Una volta definiti i meccanismi d’azione cruciali per la PLTX, esperimenti sono stati condotti anche con due dei suoi analoghi, la 42-idrossi-palitossina e l’ostreocina-D.
Parallelamente agli studi in vitro, sono stati studiati gli effetti della somministrazione orale ripetuta della PLTX nel topo. Infatti, gli studi in vitro non sono sufficienti alla comprensione del reale pericolo associato ad un contaminate alimentare, dal momento che, le molecole, una volta a contatto con l’organismo, possono subire assorbimento, distribuzione e metabolismo prima di raggiungere il tessuto bersaglio. La somministrazione a breve termine della tossina (7 giorni) ha rivelato tossicità a tutte le dosi somministrate, e letalità è stata registrata negli animali trattati già alla dose di 30 µg/kg. Le analisi istologiche hanno evidenziato alterazioni a carico di diversi tessuti: a livello polmonare sono stati osservati severi processi infiammatori associati anche a focolai di necrosi. Le alterazioni del tessuto muscolare erano visibili come degenerazione e separazione delle fibre nel cuore e aumento degli elementi cellulari tra le fibre del muscolo scheletrico. Inoltre sono stai osservati, deplezione del contenuto di glicogeno negli epatociti e moderate alterazioni della milza. I dati raccolti nel presente elaborato hanno rivelato, per la prima volta, la tossicità della palitossina a dosi molto inferiori rispetto a quelle correntemente utilizzate della European Food Safety Authority (EFSA) per la stima di valori limite per la presenza di questi composti nei prodotti ittici destinati ad uso alimentare. Per questo motivo, i risultati avranno probabilmente un considerevole impatto a livello legislativo e un’importanza cruciale per la protezione dei consumatori.XXIV Ciclo198
