2009/2010La Palitossina (PLTX), una delle biotossine marine più tossiche finora note, è saltata agli onori
della cronaca in seguito al suo frequente rilevamento in campioni di una microalga tropicale,
Ostreopsis ovata, ormai diffusa anche in Mar Mediterraneo, dove sono stati segnalati più volte
problemi respiratori in concomitanza alla sua presenza. La tossina è stata rilevata anche in
molluschi ed altri prodotti ittici, che possono fungere da vettori per l’ultimo anello della catena
alimentare, l’uomo. Poiché in paesi tropicali sono stati segnalati casi di intossicazione gravi, anche
letali, in seguito all’ingestione di pesci e crostacei contaminati con PLTXs, si rende necessario
monitorare la presenza di questi composti nei prodotti ittici e/o nelle microalghe produttrici, anche
in assenza di una legislazione in merito.
All’inizio di questo lavoro erano disponibili solo pochi dati relativi alla tossicità acuta di questo
composto, spesso purificato con protocolli non perfezionati. Poiché anche i dati clinici disponibili
non permettevano un’esatta definizione dell’Acute Reference Dose (ARfD), necessaria per
determinare i livelli massimi di tossina ammissibili nei prodotti ittici, si è deciso inizialmente di
studiare la tossicità acuta della PLTX (e di un analogo 42-OH-PLTX) dopo somministrazione orale
nel topo. I sintomi e le analisi cliniche condotte sui topi hanno indicato un coinvolgimento del
sistema neuromuscolare. Questo studio, insieme ad altri pubblicati nel frattempo, hanno permesso
agli esperti dell’EFSA di definire la concentrazione di 30 μg di tossina per Kg di polpa di molluschi
quale livello al di sopra del quale si possano manifestare effetti tossici nell’uomo.
Si è proceduto poi alla messa a punto di due saggi per la determinazione di questi composti: un
saggio strutturale di tipo ELISA ed uno funzionale, il saggio emolitico.
Il saggio ELISA (sandwich indiretto) è stato messo a punto utilizzando l’anticorpo monoclonale
73D3, e un anticorpo policlonale di coniglio prodotto presso l’Università di Trieste. Il saggio rileva
la PLTX in un range di concentrazioni che vanno da 1,25 a 40 ng/ml ed è in grado di quantificare
con la stessa sensibilità anche la 42-OH-PLTX, isolata e caratterizzata dal punto di vista chimico
durante questo periodo di dottorato dal gruppo del prof. E. Fattorusso (Università di Napoli
Federico II), in un campione di palitossina gentilmente fornitoci dal dr. M. Poli (Maryland, USA). Il
saggio ELISA è in grado di rilevare anche l’Ostreocina-d, un altro analogo della PLTX, ma a
concentrazioni maggiori rispetto a quelle della PLTX (³40 ng/ml). Il mancato rilevamento di acido
okadaico, acido domoico, brevetossina-3, saxitossina e yessotossina (tossine che possono essere
presenti insieme alla PLTX nei prodotti ittici contaminati) indica la specificità del saggio.
Siamo poi passati alla messa a punto del saggio emolitico, ampiamente usato in letteratura per il
rilevamento di PLTX e di composti palitossino-simili. Questo saggio sfrutta la capacità della tossina
di indurre emolisi tardiva probabilmente tramite l’alterazione della Na+/K+-ATPAasi (NAKA). In
letteratura, però, non è disponibile un protocollo standardizzato e la variabilità dei risultati riportati
è notevole. Si è pertanto proceduto a realizzare il saggio emolitico, esplorando le variabili che ne
influenzano la performance, ottenendo una EC50 = 13,2 pM per la PLTX. Gli anticorpi monoclonale
e policlonale anti-PLTX hanno inibito con equa potenza l’emolisi indotta da PLTX e possono
quindi essere usati per verificare la specificità dell’emolisi in campioni incogniti.
Dopo aver verificato che anche la 42-OH-PLTX condividesse lo stesso recettore della PLTX
mediante un saggio di binding indiretto alla NAKA (EC50 di 28.2 nM e 29.4 nM rispettivamente per
42-OH-PLTX e PLTX), è stato eseguito il saggio emolitico anche sulla 42-OH-PLTX, ottenendo
dei risultati analoghi (EC50 = 7.6 pM) a quelli della PLTX.
Nell’ottica di un utilizzo di questo saggio in situazioni di monitoraggio si è valutata la possibilità
di ridurre i suoi tempi di esecuzione e in tal senso, cambiando la concentrazione salina della
soluzione tampone al 62 % di quella normale, si è riusciti a ridurre il tempo di incubazione di 4
volte (1 h anziché 4 h). La curva concentrazione-risposta ottenuta dopo incubazione di 1 h con la
PLTX in tampone al 62 % è risultata perfettamente sovrapponibile a quella ottenuta dopo 4 h di
incubazione della tossina in tampone 100%. Al contrario, nessuna delle concentrazioni di PLTX
testate ha dato emolisi dopo incubazione di 1 h della tossina in tampone 100%. Questo aspetto è
particolarmente interessante perché permetterebbe di distinguere l’emolisi dovuta a palitossina da
una emolisi aspecifica, semplicemente conducendo il saggio in 1 ora in parallelo nei due tamponi
62 % e 100 %, evitando l’uso di anticorpi anti-PLTX. In particolare, nel caso di un campione ignoto
che dia emolisi in PBS al 62 % e non in PBS al 100 %, il risultato fornirebbe un primo indizio della
presenza di palitossina, da confermare con metodi di riferimento (LC-MS). Se invece l’emolisi
avviene ad entrambe le concentrazioni di PBS, dopo incubazione per 1 ora, essa potrebbe dipendere
da un’azione aspecifica non imputabile alla sola palitossina.
La presenza di una proliferazione massiccia (6.700.000 di cellule/litro) di Ostreospis cf. ovata nel
Golfo di Trieste, ci ha permesso di utilizzare gli anticorpi monoclonale e policlonale per la
localizzazione immunocitochimica delle tossine nelle singole cellule di microalghe. Per la prima
volta è stata così visualizzata la presenza delle palitossine in cellule di Ostreopsis cf. ovata, che
risultano distribuite in tutto il citoplasma. La positività per le tossine è stata verificata in tutte le
cellule di Ostreopsis analizzate, mentre nessuna cellule di Coolia monotis osservate è risultata
positiva, a conferma della specificità verso la PLTX del segnale degli anticorpi. L’analisi HR LCMS
ha evidenziato la presenza di ovatossine-a, -b, -c, -d/-e, con una forte prevalenza di ovatossinaa
(circa 80%, 45-64 pg/cellula), mentre per la prima volta in un campione naturale non è stata
rilevata la presenza di PLTX. Questi risultati ci hanno permesso di concludere che entrambi gli
anticorpi utilizzati sono in grado di riconoscere anche le ovatossine, analoghi della palitossina
preponderanti nel Mar Mediterraneo. Inoltre, la tecnica immunocitochimica eseguita direttamente
sulle microalghe potrebbe permettere un’allerta precoce della presenza di palitossine, ad esempio
prima del loro ingresso/accumulo nella catena alimentare, evitando eventuali problemi per la salute
pubblica.
Un altro approccio per il rilevamento della tossina è stato fatto utilizzando la spettroscopia Raman.
La palitossina (il cui spettro Raman è stato qui registrato per la prima volta) è stata ricercata in
singole cellule di Ostreospis, depigmentate con acetone-esano 1:1. Non sono stati riscontrati segnali
univocamente attribuibili alle palitossine negli spettri Raman di Ostreopsis, probabilmente a causa
della loro uniforme diffusione citoplasmatica, come visualizzato in immunocitochimica. Nelle
cellule non depigmentate con acetone:esano 1:1 è stata confermata le presenza del carotenoide
peridinina. L’analisi Raman di cellule in coltura di Ostreopsis cf. ovata nelle diverse fasi di crescita
ha evidenziato forti segnali associabili ad acidi grassi polinsaturi, già riscontrati in Ostreopsis cf.
ovata con altre tecniche.
L’analisi HR LC-MS delle cellule in coltura nelle varie fasi di crescita ha mostrato, analogamente
alle relative popolazioni naturali, un elevato contenuto di ovatossina-a (circa 55%, 7.5–19.7
pg/cellula) e minori quantità di altre ovatossine, con la palitossina presente in tracce (< 0,1
pg/cellula). Si è osservato che il contenuto di tossine aumenta con l’età della coltura, con le cellule
in fase senescente (giorno 25 dall’avvio della coltura) contenenti circa il doppio di tossina delle
cellule in fase stazionaria (giorno 18). Quindi, analogamente a quanto si verifica per altri metaboliti
secondari negli organismi vegetali, l’accumulo di queste tossine raggiunge il massimo generalmente
verso la fine del ciclo vitale.XXIII Ciclo198
