Etude d'une interaction protéine-protéine par ingénierie et marquages chimiques

Abstract

Les travaux de recherche réalises au cours de cette thèse au sein du département d'ingénierie et d'étude des protéines du CEA/SACLAY, sont situés à l'interface de la chimie et de la biologie. En effet, l'objectif a été de concevoir, développer, puis exploiter de nouveaux outils chimiques pour l'étude structurale d'une protéine membranaire essentielle à la communication intercellulaire au niveau des jonctions neuromusculaires et du système nerveux. Cette protéine, le récepteur nicotinique de l'acétylcholine (NACHR), est impliquée dans un certain nombre de myopathies et de pathologies du système nerveux. Elle est également la cible de peptides antagonistes toxiques, issus de divers venins, qui se lient de manière quasi-irréversible au site du neurotransmetteur. Comme la plupart des protéines membranaires, cette macromolécule n'a pu être cristallisée et sa structure tridimensionnelle n'est pas connue. De nombreuses disciplines, telles que la biologie moléculaire, la microscopie électronique, l'électrophysiologie ou bien les techniques de marquage chimique ont été largement utilisées afin d'en proposer un modèle. Au cours de cette thèse, le marquage chimique a été particulièrement aborde grâce a une nouvelle génération de sondes obtenue par ingénierie chimique de la toxine de naja nigricollis. Jusqu'à présent, les toxines extraites de venins étaient statistiquement mono modifiées sur les résidus lysines. Dans notre cas, des analogues de la toxine, modifies en un site prédétermine, ont été synthétisés sur support solide en remplaçant un acide amine du site toxique par un résidu cystéine. Cet acide amine peut alors être aisément couple à un réactif spécifique des fonctions thiols. Ainsi, deux types de groupements électrophiles ont pu être greffes régiospécifiquement sur la toxine grâce a des synthons bifonctionnels. Le premier, homobifonctionnel, est de type bis-maléimide. Le deuxième, hétérobifonctionnel, est couple à la toxine par l'intermédiaire d'un pont disulfure et porte un groupement photoactivable de type aryldiazonium. Des expériences de marquage d'affinité, réalisés a l'aide de 15 sondes de type maléimide, sur le récepteur réduit régiospécifiquement ont permis d'affiner le modèle d'interaction moléculaire toxine-récepteur : un pont disulfure implique dans la fixation du neurotransmetteur a été localise par rapport a la toxine, positionnant dans l'espace des résidus importants du récepteur par rapport a un antagoniste de nature protéique. Ces résultats ont apporte une information essentielle a l'identification de l'empreinte du site toxique du ligand sur le récepteur. Par la suite, d'autres indices pourront être obtenus par marquage de photoaffinité grâce à l'utilisation de nouveaux outils performants. Ainsi, de nouveaux résultats devraient permettre de contraindre des modèles de structure tridimensionnelle de la protéine membranaire.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocPARIS-Museum Hist.Naturelle (751052304) / SudocSudocFranceF