Deux enzymes glycolytiques du protozoaire parasite Toxoplasma gondii (clonage, expression différentielle des gènes, caractérisation enzymatique et phylogénie)

Abstract

L'interconversion du tachyzoite virulent et du bradyzoite quiescent est un processus important dans la pathogenese du protozoaire parasite toxoplasma gondii. Les bases moleculaires impliquees dans cette differenciation parasitaire ne sont pas definies. Une technique d'induction in vitro de la differenciation, conjuguee a la construction d'une banque soustractive, a permis de caracteriser des transcrits regules selon les stades parasitaires. Deux fragments d'adnc presentant de fortes homologies avec les enzymes glycolytiques glucose-6-phosphate isomerase (g6pi) et enolase (eno1) ont ete isoles. Nous avons alors clone les adnc complets codant ces deux enzymes. Les deux adnc complementent des mutants bacteriens deficients en g6pi et enolase, et generent des enzymes recombinantes actives produites chez e. Coli. Le gene eno1 est exclusivement transcrit chez le bradyzoite, alors que le transcrit du gene g6pi est retrouve dans les deux stades parasitaires avec un niveau d'expression plus important chez le bradyzoite. En revanche, les proteines g6pi et eno1 sont exclusivement exprimees par le bradyzoite. Les analyses structurales et phylogeniques montrent que les g6pi et enolases de t. Gondii et p. Falciparum sont tres proches de leurs homologues chez les plantes.Une etude structure-fonction de deux boucles peptidiques, typiques des enolases de t. Gondii et p. Falciparum et de celles de plantes superieures, demontre leur influence sur l'activite et la stabilite de l'enzyme. Enfin, nous avons egalement isole l'adnc codant une seconde enolase. Le gene eno2 est preferentiellement transcrit chez le tachyzoite virulent. L'isoforme eno2 est specifique de cette forme. Les caracteristiques enzymatiques des deux isoformes d'enolases de t. Gondii ont ete comparees, et leurs differences d'activites pourraient temoigner du maintien de la glycolyse en accord avec les besoins specifiques des deux stades asexues de t. Gondii dans le metabolisme des carbohydrates.LILLE1-BU (590092102) / SudocSudocFranceF