Caractérisation d'un inhibiteur de kinases cycline-dépendantes de N. tomentosiformis (analyse de son rôle au cours du développement de la plante)

Abstract

Le développement d'une plante nécessite un contrôle précis entre prolifération cellulaire et différenciation. Le cycle cellulaire est contrôlé par des kinases dépendantes des cyclines (CDKs) dont l'activité est régulée à plusieurs niveaux, en particulier par des inhibiteurs (CKIs, cyclin dépendent kinase inhibitors). Le criblage d'une banque double hybride de la suspension cellulaire de tabac BY-2 avec une CDKA comme appât à permis l'isolement de deux ADNc, nommés NtKIS1a et NtKIS1b. Les deux ARNm proviennent d'un même gène de N. tomentosiformis par épissage alternatif. La séquence protéique déduite de NtKIS1a présente de fortes similarités de séquence avec les CKIs de mammifères de la famille CIP/KIP, alors que ce n'est pas le cas de NtKIS1b. En accord avec cette observation, NtKIS1a mais pas NtKIS1b inhibe in vitro l'activité kinase de complexes CDK/cycline. Pour élucider le rôle de NtKIS1a et NtKIS1b au cours du développement, leur surexpression dans différentes espèces végétales a été réalisée. Les plantes d'Arabidopsis thaliana surexprimant NtKIS1b ont un phénotype sauvage, tandis que celles surexprimant NtKIS1a présentent d'importantes modifications morphologiques. L'ensemble de nos résultats suggèrent que les modifications phénotypiques proviennent d'une inhibition de la division et montrent donc que NtKIS1a est un inhibiteur de la division in planta. Des plantes surexprimant simultanément NtKIS1a et AtCycD3;1 ont été obtenues. Leur analyse montre que la surexpression du CKI NtKIS1a restaure un développement normal des plantes surexprimant AtCycD3;l, fournissant la première évidence d'une coopération CKI-cycline in planta. Dans le but d'appréhender les liens qui existent entre le cycle cellulaire et le développement, l'expression de deux gènes a été modifiée simultanément in planta : KNAT1 (knottedl-like from Arabidopsis thaliana), impliqué dans le développement et la fonction du méristème apical caulinaire, et NtKIS1a, impliqué dans l'inhibition du cycle cellulaire. L'analyse des plantes F1 montre que la co-expression de NtKIS1a et KNAT1 renforce le phénotype des plantes 35S::KNAT1, suggérant que les produits des deux gènes coopèrent au cours du développement.Plant development requires stringent controls between cell proliferation and cell differentiation. Proliferation is positively regulated by cyclin dependent kinases (CDKs), whose activity is regulated at several levels including inhibition by CDK inhibitors (CKIs). The screen of a two-hybrid BY-2 cell suspension library with a CDKA as a bait, allows the isolation of two cDNA, named NtKIS1a and NtKIS1b. NtKIS1a and NtKIS1b mRNAs arise from the same N. tomentosiformis gene by alternative splicing. The deduced polypeptide from NtKIS1a shares strong sequence similarity with mammalian CIP/KIP inhibitors, which is not the case for NtKIS1b. Consistent with this, NtKIS1a but not NtKIS1b inhibits in vitro the kinase activity of CDK/cyclin complexes. To gain insight into the role of NtKIS1a and NtKIS1b during plant development, their overexpression in different species was achieved. Arabidopsis thaliana plants overexpressing NtKIS1b display a wild type phenotype, whereas plants overexpressing NtKIS1a display strong morphological modifications. Our results suggest that the inhibition of cell division is responsible for the phenotypic modifications and thus that NtKIS1a is a cell division inhibitor in planta. Plants overexpressing simultaneously NtKIS1a and AtCycD3;1 were achieved. Their analyze demonstrates that overexpression of the CKI NtKIS1a restores essentially normal development in AtCycD3;1 overexpressing plants, providing for the first time, evidence of Cyclin D-CKI co-operation within the context of a living plant. At the aim of highlighting the links between cell cycle and development, the expression of two genes was modify simultaneously in planta: KNAT1 (knotted1-like from Arabidopsis thaliana) involved in shoot apical meristem development and function, and NtKIS1a involved in cell cycle regulation. The analysis of the F1 plants shows that co-expression of NtKIS1a and KNAT1 enhance the KNAT1 phenotype, suggesting that the two gene products co-operate with each other during plant development.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF