Etude de la protéine Gem, un membre de la superfamille Ras

Abstract

Gem est une nouvelle protéine de la superfamille Ras (famille RGK) dont l'expression est induite dans différents types cellulaires après stimulation par des agents mitogènes. Gem possède des extensions N-terminale et C-terminale par rapport à Ras de fonctions inconnues, ainsi que des substitutions d'acides aminés dans des positions clés pour la liaison et hydrolyse du GTP. Afin de rechercher les partenaires cellulaires de Gem, est plus particulièrement ceux de cette région N-terminale, nous avons mis au point un système double hybride modifié où la protéine appât est fusionnée en position N-terminale par rapport au domaine de liaison à l'ADN de la protéine bactérienne LexA, c'est-à-dire, de polarité inversée à celle des systèmes double-hybride classiques. Nous l'avons validé en montrant qu'il conservait la spécificité d'interaction entre les GTPases Ras et Ral et ses régulateurs et effecteurs, et possédait même dans certains cas une sensibilité de détection accrue. Nous avons construit une banque d'ADNc à partir de cellules de la lignée de lymphome T humain Jurkat, que nous avons criblée en utilisant comme appât : (i) les 82 acides aminés N-terminaux de Gem fusionnés à l'extrémité N-terminale du domaine de liaison à l'ADN (DBD) de LexA ; (ii) la protéine Gem entière fusionnée à l'extrémité C-terminale du DBD de GAL4. Parmi les 20 clones positifs obtenus contenant des ADNc distincts, nous avons décidé d'en étudier deux. Ces ADNc codent pour une protéine homologue à la protéine 4.1N, et une nouvelle protéine avec un domaine RhoGAP. Nous avons mis en évidence que la nouvelle protéine à domaine RhoGAP est bien capable d'augmenter l'activité GTPase intrinsèque de GTPases de la sous-famille Rho/Rac/Cdc42, aussi bien in vitro que in vivo, et nous avons démontré par coimmunoprécipitation que Gem est capable d'interagir avec cette protéine dans des cellules eucaryotes. Ces données suggèrent que Gem pourrait jouer un rôle dans la régulation de la fonction des protéines Rho.Gem is a recently identified protein belonging to the branch RGK of the Ras superfamily of GTPases. Gem is induced in several cell types upon mitogen stimulation, and it presents N- and C-terminal extensions of unknown function when compared to Ras as well as several amino acid substitutions in key positions for GTP binding and hydrolysis. With the aim of identifying Gem partners, and in particular those interacting with its N-terminal extension, we have developed a new vector for two-hybrid studies where the bait is fused through its C-terminus with the N-terminus of the DNA-binding domain (DBD) of LexA, therefore, possessing an inverted polarity as compared with a classical two-hybrid vector. We have validated this system by showing that it allows the same specific interactions between Ras and Ra1 GTPases with their effectors and regulators as a classical two-hybrid vector, and that it even shows an increased sensibility. We have built a two-hybrid cDNA library from Jurkat cells that we have screened for Gem partners with two different baits: (i) the first 82 amino acids of Gem fused to the N-terminus of LexA DBD; (ii) full-length Gem fused to the C-terminus of GAL4 DBD. Amongst the 20 different clones obtained, two have been studied further. Their cDNAs coded for an isoform of the 4.1N protein, and for a novel protein containing a RhoGAP domain. We have shown that the new RhoGAP protein is capable of increasing the intrinsic GTPase activity of GTPases belonging to the Rho/Rac/Cdc42 branch, in vitro as well as in vivo, and we have demonstrated by co-immunoprecipitation that Gem is able to interact with this protein in eukaryotic cells. These results suggest that Gem could be implicated in the regulation of Rho GTPases function.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF