Etablissement d'un modèle animal pour la thérapie génique des épidermolyses bulleuses jonctionnelles non létales

Abstract

L'objectif de mon étude a été de mettre au point un modèle animal pour la thérapie génique cutanée. Nous avons identifié des chiens souffrant d'épidermolyse bulleuse jonctionnelle (EBJ), un groupe de génodermatoses autosomiques récessives causées par un défaut d'expression des composants des structures d'ancrage de l'épiderme au derme. Chez ces chiens, la maladie est causée par un défaut d'expression de la chaîne a3 de la laminine-5, le principal ligand d'adhésion des kératinocytes basaux. Une insertion intronique dans le gène codant pour la laminine a3 est à l'origine de la maladie, et aboutit à la production d'ARNm aberrants et à une diminution de la production de laminine-5 sauvage. La réversion phénotypique des kératinocytes canins a été réalisée par transduction rétrovirale de l'ADNc codant pour la chaîne a3 de type sauvage. Les kératinocytes transduits montrent une restauration de la capacité d'adhésion, de prolifération et de la clonogénicité. Des peaux artificielles générées in vitro à partir des kératinocytes transduits montrent une expression durable de la laminine-5 localisée à la jonction dermo-épidermique après la greffe sur des souris SCID. La greffe des épithéliums transgéniques autologues sur les chiens EBJ immunocompétents permettra d'évaluer l'éventuelle réponse immunitaire dirigée contre le produit du transgène. La laminine-5 et en particulier sa chaîne ?2 étant également impliquées dans la migration et l'invasion tumorale, nous avons procédé à la localisation chromosomique des gènes codant pour les trois chaînes de la laminine-5 chez le chien, et nous avons isolé et séquencé l'ADNc codant pour la chaîne ?2 canine.To prove the feasability and safety of gene therapy of mechanobullous diseases, we have characterized a breed of dogs suffering from a mild form of JEB, a devastating, untreatable inherited skin disease characterized by blistering and erosions of the skin. These dogs exhibit the clinical hallmarks of the human condition, associated with reduced expression and secretion of laminin-5, an heterotrimeric a3ß3?2 glycoprotein that is the principal adhesion ligand of basal keratinocytes. An intronic insertion was identified in the gene coding for the a3 chain of laminin-5 and lead to the synthesis of an aberrant messenger carrying a downstream PTC. Consequently, the JEB dog keratinocytes secrete low amounts of wild-type laminin-5. We achieved sustained expression of the transgene product by retroviral-mediated transduction of epidermal stem cells. The transduced keratinocytes displayed enhanced adhesion, proliferation and clonogenic potential, and deposited immunoreactive laminin-5 efficiently and permanently at the dermal-epidermal junction of in vitro reconstructed skin grafted into SCID mice. Our results set the basis for preclinical gene therapy on the first immunocompetent large animal model for an inherited skin disease. Expression of laminin-5 and particularly of its ?2 chain are also deregulated in number of human cancers. Because dog models of human cancers provide the opportunity to clarify the relationship between laminin-5 and tumor malignancy, we have isolated and characterized the cDNA of dog g2 chain. We have also determined the synthenic location of the dog laminin-5 loci on CFA7.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF