Elaboration d'une nouvelle génération d'hémoprotéines (couplage spécifique d'un cofacteur métalloporphyrinique sur un anticorps monoclonal)

Abstract

Une nouvelle approche a été proposée afin de préparer une nouvelle génération d'hémoprotéines, catalyseurs d'oxydations sélectives. Elle consiste à modifier un anticorps (Ac) anti-substrat, un anti-œstradiol, en lui greffant covalemment une métalloporphyrine, pour obtenir un système capable d'oxyder sélectivement des stéroïdes. La principale difficulté de cette approche réside dans le contrôle de la fixation du cofacteur à proximité au site de liaison de l'Ac. Pour mener à bien cet objectif, une stratégie en 2 phases a été développée. La première phase a consisté à étudier un potentiel site de fixation du cofacteur à proximité du site de liaison de l'Ac. D'après la littérature, le choix s'est porté sur les lysines. Afin de répertorier les résidus potentiellement fonctionnalisables, un dosage préalable des lysines accessibles ainsi que des études structurales du paratope de l'Ac ont été réalisés. Après caractérisation de la structure primaire de ce domaine, il a été possible de réaliser une modélisation 3D de cette région permettant ainsi de visualiser les lysines les plus accessibles. La deuxième phase du projet a consisté à mettre au point une molécule permettant de coupler spécifiquement le cofacteur sur l'Ac, composée d'un motif antigénique, une testostérone, couplé à une métallo-méso-tétraarylporphyrine. Pour cela, une porphyrine disubstituée en ortho a été préparée afin de lier, d'un côté le stéroïde modifié et de l'autre, l'Ac anti-stéroïde au voisinage du site de reconnaissance de l'Ac. En parallèle, la testostérone a été modifiée dans le but de lui adjoindre un bras espaceur comportant un pont di sulfure qui se situera entre le stéroïde et le cofacteur. Ce pont disulfure utilisé comme fonction sécable permettra à la suite de sa réduction de relarguer la testostérone hors du site de reconnaissance de l'anticorps. L'étape finale de ce travail sera de coupler la métalloporphyrine à l'Ac afin d'étudier l'activité catalytique de ce nouveau biocatalyseur.We propose a strategy in order to prepare a new generation of hemoproteins as selective oxidation catalysts. This new approach involves the chemical labeling of antisubstrate antibodies (Ab) with a metalloporphyrin. The developed example consists in the covalent linkage of a metalloporphyrin to an antiestradiol Ab, in order to obtain semisynthetic catalytic Abs able to catalyze the selective oxidation of steroids. The main issue of this strategy is the control of the cofactor coupling in vicinity of the Ab- binding site. Therefore, we have developed a strategy which involves two phases. First, a potential coupling site had to be determined. According to the literature, we chose lysyl residues. In order to index the potentially derivatisable lysines, we undertook a quantification of available residues and preliminary structural studies about the Ab paratope. After characterisation of the primary structure of the Ab-binding site, we modelised this region allowing us to visualize the most convenient lysines for our strategy. The second phase involves the design and preparation of a molecule consisting of an antigenic steroid moiety, a testosterone, and a metallo-meso-tetra-arylporphyrin allowing to specifically couple the cofactor to the Ab. An ortho bisubstituted porphyrin has been prepared to link in one hand a modified testosterone and in the other hand, the Ab, nearby its binding site. In parallel, the testosterone moiety has been functionalized with a spacer group including a disulfide bridge. This bridge will be used as a cleavable linkage between the steroid and the cofactor in the final molecule, so that the coupled testosterone could be released from the conjugate after reduction of this function and be easily removed by dialysis. The final aim of this work will be to couple the metalloporphyrin to the Ab and to study the catalytic activity of this new biocatalyst.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF