Thérapie génique (stratégie suicide humanisée et évaluation du transfert de genes par vecteurs lentiviraux)

Abstract

Gene therapy is a new approach of Medicine creating the notion of "gene-medicine". During my thesis, I mainly participated to development and evaluation of four essential components of gene therapy strategies : transfer, expression, and control of the therapeutic gene, as well as the future of the therapeutic targets, the transduced cells. In a first part of this work, we try to develop a system of induced and targeted apoptosis. This system relies on the expression of an inducible caspase 8 controlled by a "specific" promoter, and transfered in target cells by a viral vector. The main point of this strategy is the evaluation of an inducible caspase 8 as a "therapeutic" gene. We compared two transcriptional regulation systems, and a post-translational one. We eventually proposed a modified form of human caspase 8 inducible by an homodimerization regulated system as an alternative system to suicide gene HSV-tk. We also considered controlling expression of this proapoptotic gene with a promoter "specifically" active in cells transformed by a mutated form of Ras, our first cellular model. In a second part, we were interested in gene transfer systems, and more particularly in entiviral vectors. Our first study model was the 3T3-L1 adipocyte system, one of the main cellular model used in obesity and diabetes fields of research, but hardly transfectable by usual transfection methods. We show that HIV-1 derived lentiviral vectors efficiently transduce quiescent and fully differentiated 3T3-L1 adipocytes, as well as 3T3-L1 dividing pre-adipocytes. Furthermore, contrary to adenoviruses, there's no overt signs of cytotoxicity, as confirmed by the glucose uptake physiological assay. Moreover, we checked that capacity to differentiate is not affected by the transduction of 3T3-L1 pre-adipocytes. We thus show that 3rd generation of lentiviral vectors are the system of choice for genetic modification of 3T3-L1 pre-adipocytes and mature adipocytes. Finally, we established several collaborations offering attracting applications for such a system, not only as gene vectorisation system, but also as a stable ectopic expression system that can be combined with other technologies like siRNA. To conclude, it's important to note that if clinical applications in this kind of approaches are long-term prospects, even very long-term, for security and efficiency reasons, such technologies can find multiple applications in various fields of research as a commun tool of molecular biology.La thérapie génique est une nouvelle approche de la médecine créant la notion de gènes-médicaments. Au cours de ma thèse, j'ai participé principalement au développement et à l'évaluation de quatre composants essentiels d'une approche de thérapie génique : le transfert, l'expression et le contrôle du gène thérapeutique, ainsi que le devenir des cibles thérapeutiques, les cellules transduites. Dans une première partie de notre travail, nous avons tenté de développer un système d'apoptose inductible et ciblée. Ce système est basé sur une caspase inductible dont l'expression est contrôlée par un promoteur " spécifique ", et transférée dans la cellule cible par un vecteur viral. Le point central de cette stratégie a été l'évaluation d'une caspase 8 inductible comme gène " thérapeutique ". Nous avons comparé pour cela des systèmes de régulation transcriptionnelle ainsi qu'un système de régulation post-traductionnelle, et nous proposons finalement une caspase 8 humaine inductible par un système d'homodimérisation régulée comme une alternative au gène suicide HSV-tk. Nous avons également considéré le contrôle de l'expression de ce gène grâce à un promoteur " spécifique " de cellules transformées par une forme activée de Ras, notre premier modèle d'étude. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés au système de transfert de matériel génétique et plus particulièrement aux vecteurs lentiviraux. Notre premier modèle d'étude a été le système adipocytaire 3T3-L1, un des principaux modèles cellulaires pour les études concernant l'obésité, le diabète, mais très difficilement transfectable par les méthodes usuelles. Nous montrons que des adipocytes 3T3-L1 quiescents et pleinement différenciés, aussi bien que des pré-adipocytes 3T3-L1 en division, sont efficacement transduits par les vecteurs lentiviraux dérivés du HIV-1. De plus, contrairement aux adénovirus, les lentivirus n'engendrent aucun signe de cytotoxicité apparent, comme le confirme le test physiologique d'absorption du glucose en réponse à l'insuline. Nous avons également vérifié que la transduction des pré-adipocytes 3T3-L1 n'affecte en rien leur capacité à se différencier. Nous montrons donc que les vecteurs lentiviraux de 3ème génération constituent le système de transfert de choix pour la modification génétique des pré-adipocytes et adipocytes matures 3T3-L1. Enfin, nous avons établi plusieurs collaborations offrant des applications attrayantes pour un tel système, non seulement en tant que stratégie de vectorisation de gènes, mais aussi comme outil d'expression ectopique stable pouvant notamment être combiné avec d'autres technologies comme les siRNA. En conclusion, il est important de noter que si les applications cliniques de ce type d'approche restent des perspectives à long terme, voire très long terme pour cause d'aspects sécuritaires et d'efficacité encore insuffisants, une telle technologie peut trouver de multiples applications dans des domaines très divers comme outil commun de biologie moléculaire.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF