Bases cytologiques et moléculaires de la dégradation enzymatique du son de blé tendre (thèse pour le doctorat en sciences spécialité Biochimie)

Abstract

Le son de blé est un co-produit de l'agriculture abondant pour lequel la valorisation des arabinoxylanes (AX) par une endoxylanase est envisagée. En effet, le son de blé tendre (Triticum aestivum) désamidonné est riche en AX, environ 40%, et comprend des couches cellulaires d'origine distinctes: le péricarpe, la testa, la couche nucellaire, et la couche à aleurone. Cette complexité tissulaire et cellulaire se traduit par une grande hétérogénéité pariétale. Afin de mieux comprendre dans quelle mesure l'hétérogénéité histologique, cellulaire et pariétale entraîne des limitations dans l'accessibilité et l'action de l'enzyme, nous avons développé une stratégie basée sur la caractérisation chimique et la visualisation in situ de l'action de l'enzyme. Des sons industriels désamidonnés dont les teneurs en polysaccharides, protéines, acides hydroxycinnamiques (HCA) et diféruliques (DiFA), et le ratios A/X présentent des taux distincts de dégradation par la xylanase. En particulier, la proportion en DiFA des sons de blé résiduels à l'action xylanolytique est négativement corrélée avec les taux de solubilisation des AX, suggérant que les caractéristiques des AX et leurs interactions au sein des parois sont des facteurs limitants. L'importance du ratio A/X et de l'état physique du substrat a été abordée par une étude comparative sur deux xylanases thermostables. Les valeurs des paramètres cinétiques indiquent que malgré son aptitude à dégrader des substrats très substitués, la xylanase de la famille 10 est moins efficace que celle de la famille 11 pour solubiliser les AX insolubles du son. Les résultats concernant la dégradation enzymatique d'enveloppes de grains prélevés à divers stades de maturation suggèrent que la présence d'acides féruliques et le faible dépôt de lignine dans les enveloppes n'altèrent pas l'efficacité de l'enzyme. Comme pour les enveloppes issues de grain matures, l'aleurone et la couche nucellaire sont fortement dégradés alors que le péricarpe reste intact quel que soit le stade de maturité. L'immunolocalisation d'une xylanase (famille 11) sauvage ou sa forme mutante inactive, et d'AX faiblement substitués a été réalisée sur du son ou sur ses couches individualisées. Sur le son, la xylanase active est d'abord retrouvée dans les parois de l'aleurone côté albumen amylacé, puis progresse unilatéralement au travers de l'aleurone et au final dégrade la couche nucellaire. Des micro domaines résistants sont toutefois apparents. A l'opposé, la présence de xylanase n'est pas observée dans le péricarpe et la testa, pour lesquels aucun marquage des AX non substitués n'a été détecté. En plus de la barrière physique représentée par les couches cuticulaires, le réseau pariétal peut également limiter à la fois la pénétration et la diffusion de l'enzyme. En l'occurrence, la pénétration de la xylanase est facilitée par la dégradation des arabinoxylanes dans les parois sensibles à son actionWheat bran is an abundant agricultural by-product for which xylanase upgrading of arabinoxylans (AX) is of interest. Indeed, starch-depleted wheat bran (Triticum aestivum) is rich in AX (about 40%) and includes botanically distinct layers: the pericarp, the testa, the nucellar layer and the aleurone layer, resulting in a mixture of chemically heterogeneous cell-walls. To better understand the way by which the chemical heterogeneity of the bran cells, the cell-wall network and the tissular organization hamper both accessibility and enzyme action, we have devised a strategy based on chemical analysis and in situ visualisation of the xylanase action. Industrial destarched wheat brans display significant variations in carbohydrate, A/X ratio, protein, hydroxycinnamic acid (HCA) and diferulic acid (DiFA) contents and differed in their susceptibility to xylanase. Notably the total DiFA in enzyme-depleted bran was negatively correlated with the amount of soluble AX, suggesting that both structural feature of AX and cross-linking were limiting factors. The impact of the A/X ratio and the physical state of the substrate was further studied while comparing two thermostable xylanases. In spite of its ability to disrupt highly substituted AX, the xylanase from family 10 is less efficient than the family 11 xylanase for AX solubilisation from the insoluble wheat bran in respect to their kinetic parameters. Examination of the enzymatic degradation of the external layers isolated from maturing wheat grain suggests that the slight lignin deposition and ferulic accumulation would not significantly alter enzyme efficiency. As for mature wheat bran, aleurone and nucellar layers were mostly degraded whereas pericarp stayed intact at all stages of maturation. Immunocytochemical localization of both feebly substituted arabinoxylans and xylanase family 11 (active and engineered inactive forms) was performed using wheat bran and micro-dissected layers. In wheat bran, the active xylanase was confined to the AL cell walls close to the endosperm, and then progressed unilaterally throughout the AL and finally attack the nucellar layer; some resistant micro domains were also evidenced. In contrast, no enzyme was observed in the pericarp and the testa that did not show any labeling with the non-substituted AX antiserum. Apart from the physical barriers provided by the cuticle layers, the cell wall network would also restrict enzyme penetration and diffusion. Thereby, xylanase penetration was facilitated by the concomitant depletion of arabinoxylans in enzyme-sensitive cell wallsREIMS-BU Sciences (514542101) / SudocSudocFranceF