Caractérisation fonctionnelle de glycérolipases de type "patatine" induites lors de la réaction d'hypersensibilité chez le tabac (Recherche de leur implication dans la biosynthèse d'oxylipines)

Abstract

La libération d'acides gras à partir des lipides membranaires est à l'origine de la synthèse d'une variété de signaux et composants antimicrobiens impliqués dans les réponses de défense chez les plantes. Des travaux antérieurs au laboratoire ont conduit à l'isolement de trois cDNAs de feuille de tabac (NtPAT1, NtPAT2 et NtPAT3) similaires au gène codant la patatine, une protéine majeure du tubercule de pomme de terre qui possède une activité lipide acyle hydrolase (LAH) faible. Ces gènes sont rapidement induits lors de la réaction hypersensible (HR) au virus de la mosaïque du tabac (VMT), cette induction précédant l'accumulation de jasmonates. Une étude détaillée de la régulation des gènes NtPAT a montré qu'ils sont également induits par la bactérie E. carotovora et le champignon B. cinerea. Le traitement de feuilles par la b-mégaspermine, un éliciteur de mort cellulaire, induit fortement les gènes NtPAT dans la zone infiltrée avant l'apparition de la nécrose puis, plus tardivement, dans la zone périphérique. Dans les tissus infiltrés, l'expression de ces gènes est également associée à la production de jasmonates. Par ailleurs, les gènes NtPAT sont corégulés avec des gènes codant des enzymes du métabolisme des oxylipines comme la 9-LOX, l'a-DOX, la DES et des hydroxylases d'acides gras de type P450s. Ceci suggère l'implication des protéines NtPAT dans la libération d'acides gras permettant d'alimenter différentes branches du métabolisme des oxylipines. Pour chaque inducteur, l'expression des gènes NtPAT a lieu avec un profil parallèle à l'apparition d'une activité phospholipase A2 Dans les feuilles traitées à la b-mégaspermine, elle est également corrélée à la dégradation de phospholipides, de galactolipides et est concomitante à l'accumulation d'acides gras libres. Notre hypothèse est que ces activités sont dues principalement aux protéines NtPAT. En effet, la production des protéines recombinantes NtPAT1 et NtPAT3 chez E. coli a permis de montrer que ces enzymes possédaient une très forte activité LAH. Tout d'abord décrites comme des PLA2, elles sont en fait capables de déacyler les positions sn-1 et sn-2 de phospholipides comme de galactolipides. Elles sont par contre inactives sur les triglycérides. Bien que fortement actives sur les galactolipides, des données préliminaires, obtenues par immunolocalisation et expression de fusions à la GFP, suggèrent que les enzymes NtPAT sont cytoplasmiques. Au vu de la corrélation stricte entre l'apparition des protéines NtPAT et la dégradation massive de galactolipides pendant la HR, une hypothèse est que ces protéines sont capables d'hydrolyser l'enveloppe externe des chloroplastes à partir du cytoplasme. Cette hypothèse devra être validée par l'étude du profil métabolique de plantes incapables de produire les protéines NtPAT. De telles plantes sont actuellement en cours d'étude. Des plantes transgéniques exprimant constitutivement NtPAT3 ont également été obtenues. Celles-ci présentent une résistance accrue au VMT, ce qui conforte l'hypothèse d'un rôle des protéines NtPAT dans la résistance aux agents pathogènes.The release of fatty acids from membrane lipids is at the origin of the biosynthesis of an array of signals and antimicrobial derivatives in plant defense. The enzymes catalyzing this hydrolytic step are poorly characterized. Previous work done in our laboratory has led to the isolation of three tobacco genes (NtPAT1, NtPAT2 and NtPAT3) related to the patatin, a major protein from the potato tuber that displays weak lipolytic activity. These genes are rapidly induced during the hypersensitive response (HR) to tobacco mosaic virus, in advance to jasmonate accumulation. A detailed study of the regulation of NtPAT genes showed that these genes are also induced after infection by the bacterium E. carotovora and the fungi B. cinerea. The treatment with b-megaspermin, a cell death-inducing protein elicitor also induced NtPAT genes which are then rapidly expressed in the infiltrated zone before the appearance of necrosis and in the surrounding area with some delay. In the infiltrated tissue, NtPAT gene expression is associated with the accumulation of the two jasmonates, OPDA and JA. In elicitor treated leaves, NtPAT gene are corregulated with several genes encoding proteins involved in oxylipin metabolism such as 9-LOX, a-DOX, DES and some P450s fatty acid hydroxylases. This suggests that NtPAT proteins are involved in providing fatty acids for different oxylipins biosynthetic pathways. In each challenge, NtPAT gene expression also appears with a profile parallel to the appearance of PLA2 activity. In b-megaspermin treated leaves it is also correlated with the degradation of phospholipids and galactolipids, and the accumulation of free fatty acids. We hypothesised that NtPAT proteins are mostly responsible for these activities. Indeed, recombinant expression in E. coli showed that NtPAT1 and NtPAT3 encode proteins with huge lipolytic activity. First described as PLA2, NtPAT proteins are in fact able to cleave both sn-1 and sn-2 positions of phospholipids and galactolipids, but are completely inactive on storage triglycerides. Although they are strongly active on galactolipids, the preliminary results we obtained on the sub-cellular localization of NtPAT, using both immunolocalization and GFP fusion proteins, suggest that these proteins are cytosolic. As galactolipids are only present in the chloroplasts and NtPAT proteins are expressed while the massive galactolipid consumption occurs during the HR, one hypothesis is that these proteins are able to hydrolyze the chloroplastic outer membrane starting from the cytosol. Fatty acids released in this case could supply the chloroplastic 13-LOX pathway but may also supply the cytoplasmic 9-LOX pathway as can do fatty acids released from other membranes. This hypothesis will only be validated by metabolic profiling of transgenic plants depleted in NtPAT proteins. Such plants are currently being studied. Transgenic plants overexpressing NtPAT3 have also been obtained. These plants display increased resistance to tobacco mosaic virus reinforcing the involvement of NtPAT proteins in resistance against pathogens.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF