Création et caractérisation d'outils génétiques destinés à visualiser les réseaux neuronaux chez la souris

Abstract

Le fonctionnement du système nerveux central (SNC) des mammifères met en jeu la communication entre les neurones reliés entre eux par des connexions synaptiques et formant des réseaux neuronaux. Afin d étudier la formation, le maintien et le fonctionnement des réseaux neuronaux, nous avons développé et amélioré de nouveaux outils génétiques codant pour deux types de protéines, fluorescentes ou bioluminescentes : La protéine hybride fluorescente GFP-TTC qui conserve les propriétés de transport rétrograde et trans-synaptique de la toxine tétanique tout en étant dépourvue de toxicité. Cette protéine est ainsi un marqueur anatomique des réseaux de neurones actifs connectés entre eux. Différentes constructions moléculaires gfp-ttc contenant une séquence IRES et des sites loxP, ont été fabriquées dans le but de construire des souris rapporteurs universels pouvant exprimer ces constructions de manière ubiquitaire dans tous les neurones du SNC. L idée, à plus long terme, mais qui ne fait pas partie de ce travail, est de croiser ces souris rapporteurs avec des souris exprimant la recombinase Cre dans des sous-populations de neurones très spécifiques afin d étudier les réseaux neuronaux associés à ces populations neuronales. Deux souris transgéniques, chacune contenant une version différente du transgène gfp-ttc, ont été obtenues à l issue de ce travail de thèse. Le premier animal, obtenu par transgenèse classique, ne présentait malheureusement pas une expression ubiquitaire du transgène et ne pourra donc pas être utilisé comme souris rapporteur universel . Néanmoins, le transgène est exprimé dans des régions spécifiques du SNC et notamment dans la rétine au cours de l embryogenèse jusque chez l adulte. Par ailleurs, son expression est sélective des cellules bipolaires et ganglionnaires de la rétine, faisant de la protéine fluorescente GFP-TTC un marqueur fluorescent spécifique de ces types cellulaires. En conséquence, cette lignée de souris pourrait représenter un outil de choix pour suivre anatomiquement le développement, la migration et l architecture des ces neurones rétiniens au cours des stades embryonnaires et adultes. Suite à cet échec, nous avons généré un second animal transgénique par recombinaison homologue au locus HPRT afin d optimiser l expression ubiquitaire du transgène. Cet animal, obtenu très récemment, est en cours de caractérisation et nous espérons vivement qu il exprimera gfp-ttc de manière ubiquitaire. Ce travail de transgenèse a été parallèlement complété par une étude de caractérisation des propriétés moléculaires et cellulaires des facteurs agissant sur l internalisation neuronale de la sonde GFP-TTC à la synapse neuromusculaire. L idée était d identifier la voie de transport intracellulaire utilisée par la protéine GFP-TTC dans le but de pouvoir ensuite améliorer le transport intracellulaire et trans-synaptique de cette sonde. Ainsi, des expériences de coinjection de la protéine GFP-TTC et des neurotrophines BDNF ou NT-4 dans le muscle, nous ont permis de mettre en évidence une augmentation de l endocytose de la protéine GFP-TTC en présence de ces neurotrophines. Ces résultats suggèrent la présence d un mécanisme d internalisation similaire entre ces neurotrophines et la sonde GFP-TTC. La protéine hybride bioluminescente GFP-aequorine (GA) qui est sensible au Ca2+. Sa liaison au Ca2+ entraîne l émission de lumière verte ( max=509nm) et permet de suivre les variations de concentrations calciques associées à l activité cellulaire. Afin d étudier l activité de réseaux neuronaux, provenant des régions profondes du cerveau de la souris adulte, nous avons dû construire de nouvelles sondes bioluminescentes en se basant sur le transfert d énergie chimioluminescente, retrouvé dans GA. Deux nouvelles sondes génétiquement codées ont ainsi été obtenues : Venus-aequorine (VA) et mRFP1-aequorine (RA) dont les signaux luminescents ont été déplacés vers les longueurs d ondes rouges par rapport à GA. Nous avons observé que l intensité bioluminescente de la sonde VA était plus importante que celle de RA. Toutefois, seul le signal émis par RA (dans un rouge plus lointain que le signal émis par VA) et provenant de régions profondes du cerveau de la souris adulte, s est avéré être détectable. Cette amélioration, par déplacement de la bioluminescence vers des longueurs d ondes lointaines, représente une avancée technique dans le développement des nouvelles technologies d imageries du petit animal. Ces deux nouvelles sondes sont en cours d être brevetées par l Institut Pasteur. En conclusion, l ensemble de ce travail de thèse a essentiellement consisté en (1) la création, l amélioration et la caractérisation de nouvelles sondes génétiques (destinées à l analyse de l activité des réseaux neuronaux) et (2) la génération de souris transgéniques exprimant certaines de ces sondes. Le développement de tels outils biotechnologiques se place en amont d études à plus long terme du développement et de l activité des réseaux neuronaux chez l animal vivant.PARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF