Régulation de l'épissage alternatif par des facteurs d'épissage de la famille des protéines SR dans des situations physiologiques ou pathologiques

Abstract

Les protéines SR jouent un rôle crucial dans les processus de maturation des précurseurs d'ARNm, et plus particulièrement dans la régulation de l'épissage alternatif. Ce mécanisme permet la synthèse de multiples ARNm à partir d'un unique précurseur, et constitue un moteur essentiel de la diversité protéique chez les eucaryotes supérieurs. L'activité des protéines SR est régulée par la phosphorylation de leur domaine RS, riche en résidus arginines et sérines, par plusieurs familles de protéines kinases et dont l'ADN topoisomérase I (Topo I). En utilisant des cellules résistantes à un inhibiteur de la Topo I, nous avons observé que la résistance à la camptothécine est étroitement liée à l'extinction de l'expression de cette enzyme. L'absence de Topo I est corrélée à une hypophosphorylation des protéines SR et à des défauts d'épissage alternatif, ce qui suggère que l'activité kinase de la Topo I n'est pas redondante avec celle d'autres protéines et est nécessaire pour les processus d'épissage alternatif in vivo. Les protéines SR jouent un rôle essentiel au cours du développement, mais paradoxalement, leur fonction dans ce processus reste élusive. Chez la drosophile, la surexpression de diverses protéines SR, dans les disques imaginaux d'œil et dans le cerveau de larves, induit des défauts de développement de ces tissus. Nous avons identifié les ARNm associés à dASF/SF2 et à B52, et nous avons montré que la surexpression de ces deux protéines entraîne des altérations du profil d'épissage de certains d'entre eux impliqués, en particulier, dans le développement de l'œil et du cerveau. L'analyse du développement de ces deux tissus, au stade larvaire, a révélé que la surexpression de dASF/SF2 perturbe la différentiation de cellules de l'ommatidie, et que l'expression de B52-GFP interfère également avec le développement du cerveau. Les protéines SR régulent l'épissage des précurseurs d'ARNm en interagissant avec des séquences activatrices introniques ou exoniques, dont la fonction peut être altérée par des mutations, dans le cas de maladies génétiques. Nous avons étudié une mutation qui localisée dans l'intron 7 du gène E1a du complexe PDH, chez un patient atteint du syndrome de Leigh. Cette mutation créée une séquence spécifiquement reconnue par la protéine SC35 qui est responsable d'un épissage aberrant de l'ARNm E1aPDH à l'origine de la maladie. Nous avons montré que la réduction de l'expression de SC35 par ARN interférence permet de restaurer un épissage normal du gène E1aPDH dans des fibroblastes primaires de patients. Enfin, nous avons identifié des composés chimiques qui inhibent spécifiquement des évènements d'épissage alternatif dépendants d'une ou plusieurs protéines SR, in vitro et in vivo. De telles molécules pourraient ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter des pathologies humaines résultant de mutations génétiques qui affectent les processus d'épissage.SR proteins play a crucial role in messenger RNA maturation processes, and more precisely in the regulation of alternative splicing. This mechanism allows the synthesis of multiple mRNAs from a single precursor and is a major source of proteomic diversity. The activities of SR proteins are regulated by phosphorylation of the RS domain, rich in arginine and serine residues, by several protein kinases, including the DNA topoisomerase I (Topo I). Using cells resistant to a Topo I inhibitor, we have shown that resistance to camptothecin is correlated to the downregulation of the expression of this enzyme. Topo I depletion induces the hypophosphorylation of SR proteins as well as alternative splicing alterations, suggesting thereby that the kinase activity of Topo I is not redundant and is necessary for alternative splicing processes in vivo. As key splicing regulators, SR proteins also play an essential role during development, even if this function remains elusive. In drosophila, the overexpression of several SR proteins, in larval eye imaginal discs and brain, is responsible for developmental alterations of both tissues. We have identified candidate target mRNAs associated to dASF/SF2 and B52, and we have shown that overexpression of both SR proteins induces splicing patterns alterations for some of these mRNAs that are involved in eye and brain development. The analysis of both tissues, at the larval stage, revealed that overexpression of dASF/SF2 impairs cell differentiation within the ommatidia, when the overexpression of B52 also alters brain development. SR proteins regulate the splicing of mRNA precursors through binding of intronic or exonic enhancer sequences, which can be altered by mutations in genetic diseases. We have investigated the consequences of a mutation, located in the intron 7 of the PDH complex E1a subunit encoding gene, in a case of Leigh syndrome. This mutation creates an enhancer sequence specific for SC35, and is responsible for an aberrant splicing pattern of the E1aPDH mRNA causing the disease. Using RNA interference, we were able to restore the normal splicing pattern of the E1aPDH gene by reducing the expression level of SC35. At last, we have characterized small chemical molecules that specifically inhibit, both in vitro and in vivo, alternative splicing events regulated by one or more SR protein. Such molecules open exciting perspectives concerning therapeutical approaches to treat human diseases resulting from genetic mutations that impair splicing processes.MONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF