Dosages immunoenzymatiques plasmatiques et intracellulaires des antirétroviraux anti-VIH (synthèses d'haptènes, développements et applications)

Abstract

Le développement de méthodes de dosage sensibles et facilement utilisable en milieu hospitalier offre un moyen de mieux comprendre les mécanismes d action des antiviraux anti-VIH, d optimiser l utilisation de ces molécules afin de limiter les effets secondaires et à plus long terme individualiser les traitements. Ce manuscrit présente le développement de dosages immunoenzymatiques de trois classes d antiviraux : l AZT-TP (un INTI-TP), l efavirenz (un INNTI) et l atazanavir (un IP). Nous avons ainsi synthétisé les immunogènes et traceurs nécessaires à l obtention d anticorps spécifiques par couplage des molécules concernées avec la BSA et l AChE. Quatre haptènes, analogues stables de l AZT-TP, ont été synthétisés. Les anticorps obtenus reconnaissent l AZT-TP mais présentent de forts taux de réactions croisées avec l AZT-MP et l AZT-DP. Le dosage n a donc pas pu être finalisé. La synthèse énantioselective en sept étapes d un haptène de l EFV nous a permis d obtenir des anticorps spécifique anti-EFV, et de développer un dosage EIA de l EFV assez sensible (limite de détection < 150 pg/mL) pour être utilisé en intracellulaire. Nous avons mis en évidence l accumulation intracellulaire de l EFV (rapport intra/extra = 3) et la possible implication des P-gp dans son efflux. Nous avons aussi développé le dosage EIA plasmatique et intracellulaire de l ATV (limite de détection < 200 pg/mL). Le dosage intracellulaire nous a permis de mettre en évidence la faible accumulation de l ATV à l intérieur des CEM, l implication des P-gp dans son efflux ainsi qu une interaction significative avec l EFV dans son accumulation intracellulaire.Development of sensitive and inexpensive quantification methods may increase antiretroviral efficacy by reducing toxicity and managing drug-drug interactions. Moreover, a better understanding of action of antiretroviral (ARV) drugs requires an intracellular quantification which is considered to be the true active concentration. This manuscript describes the development of immunoassay of three antivirals classes: AZT-TP (NRTI-TP), atazanavir (PI) and efavirenz (NNRTI). We have synthetized immunogens and tracers by covalent coupling of molecules with BSA and AChE. Four haptens, stable analogs of AZT-TP, had been synthesized. Antibodies obtained after immunizations, recognized AZT-TP but also AZT-MP and AZT-DP. The immunoassay could not be fully developed. The seven steps enantioselective synhesis of EFV-hapten had been used to obtain specific anti-EFV antibodies and to develop a sensitive EIA of EFV (limit of detection < 150 pg/mL) which allows the intracellular quantification. We have observed a low intracellular accumulation of EFV and the possible implication of P-gp in its efflux. We have developed a new EIA for measuring plasma and intracellular ATV. This EIA was fully validated. Moreover, in vitro results suggested a weak intracellular accumulation of ATV and P-gp and MRP1 may be involved in the efflux of the drug. An interesting interaction with EFV had been observed.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF