Rôle des interactions moléculaires dans le processus de maturation de la protéine CFTR (implications de CSN5 et de la voie du signalosome)

Abstract

La mucoviscidose, maladie génétique la plus fréquente dans les populations d origine caucasienne, résulte de mutations dans le gène codant la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). La plus fréquente des mutations de CFTR est une délétion du codon correspondant à la phénylalanine 508 (F508del) qui est à l origine d un adressage défectueux et d une fonction altérée de la protéine. L objectif de ce travail a été d identifier des protéines interagissant avec CFTR et pouvant jouer un rôle dans son adressage, son recyclage à la membrane ou sa fonction. Pour cela, un crible double hybride de levure a été réalisé avec la troisième boucle cytoplasmique de CFTR comme appât. Ce test a permis d identifier 14 nouveaux partenaires dans la levure. L interaction de CFTR avec quatre d entre eux a ensuite été confirmée dans des modèles cellulaires humains. Le travail a été orienté ensuite vers une étude approfondie du rôle de l un de ces partenaires, CSN5, dans le processus de maturation de CFTR. Nous avons montré que CSN5, cinquième sous-unité du signalosome, interagit avec la forme mal repliée de CFTR et l envoie vers la dégradation via le protéasome. Notre étude permet de proposer un modèle de dégradation de CFTR où le signalosome constitue un nouveau point de contrôle du processus de maturation de CFTR. Par ailleurs, nous avons montré dans deux systèmes cellulaires que CFTR était NEDDylé, cette nouvelle modification post-traductionnelle étant dépendante de CSN5. Dans un dernier temps, nous avons étudié le rôle de CSN5 dans la régulation de gènes dans un contexte CF grâce à une puce ADN. L extinction de CSN5 dans des cellules épithéliales bronchiques IB3-1 (F508del/W1282X), entraîne une dérégulation de près de 400 gènes dont nombre sont impliqués dans les voies de l inflammation et de réponse au stress. Au niveau protéique, CSN5 est également impliqué dans la régulation négative de la production de cytokines pro-inflammatoires IL-8 via une stimulation par le TNFa. CSN5 interagit avec une variété de molécules de signalisation en régulant leur stabilité et peut également diriger les cellules vers une voie de réponse au stress (UPR) ou l apoptose. Identifier CSN5 comme un composant de la voie de dégradation est une étape importante dans la compréhension du processus de maturation de la protéine CFTR, impliquant potentiellement une étape de NEDDylation. De plus, CSN5 pourrait être impliqué dans le mécanisme de réponse inflammatoire exacerbée observé chez les patients CF.Cystic Fibrosis is the most common genetic disease in Caucasians and is caused by mutations in the CFTR gene (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). The most frequent mutation is the deletion of Phenylalanine 508 (F508del) that produces a protein with processing and functional defects. The aim of our work was to identify new CFTR partners, implicated in its processing, recycling or function. We realized a yeast two hybrid screening with the third cytoplasmic loop of CFTR as a bait. We identified 14 new CFTR partners in yeast with this approach. The interaction between CFTR and 4 of these proteins was confirmed in human cellular models. We then studied the role of CSN5 in CFTR processing. We showed that CSN5, the fifth subunit of signalosome, associates with misfolded CFTR and targets it to the proteasome-dependant degradation pathaway. We propose an additional degradation pathway of CFTR implicating the signalosome as a new processing checkpoint. We also showed in two different cellular models that CFTR is NEDDylated and that this new post-translational modification is CSN5-dependant. In a second study, we investigated the role of CSN5 in gene regulation in CF cells using DNA microarrays. IB3-1 cells (F508del/W1282X) treated with siCSN5 presented a deregulation of more than 400 genes, most of them implicated in inflammatory and stress response pathways. CSN5 was also found to be a negative regulator of pro-inflammatory cytokine IL-8 production in response to TNFa stimulation. CSN5 interacts with a variety of signalling molecules and regulates their stability, and is also a key molecule that directs cells towards apoptosis or stress response (UPR). Identifying CSN5 as a new component of the network of the degradative pathway is an important step towards the goal of unraveling the sorting between misfolded and correctly folded CFTR proteins, possibly implying a NEDDYlation step. Moreover, CSN5 could be considered in the mechanisms of excessive inflammatory response observed in CF patients.PARIS12-CRETEIL BU Multidisc. (940282102) / SudocSudocFranceF