Les déterminants moléculaires et cellulaires de la mutation humaine R482X de la sous-unité Cavb4 impliqués dans l épilepsie

Abstract

Les canaux calciques neuronaux activés par la dépolarisation membranaire contrôlent diverses fonctions cellulaires telles que l excitabilité neuronale et la transmission synaptique. Les canaux calciques sont formés d une sous-unité principale Cav associée à 3 sous-unités régulatrices (b, a2d et g). La sous-unité auxiliaire Cavb joue un rôle crucial dans la régulation des propriétés biophysiques du canal et dans l adressage membranaire de la sous-unité Cav. Chez l homme, un isoforme de cette sous-unité Cavb4 est l objet de mutations qui conduisent à des phénotypes épileptiques. L une de ces mutations est une délétion d une partie du domaine carboxy-terminal de Cavb4 (R482X). Les efforts effectués pour comprendre les mécanismes cellulaires du phénotype épileptique des patients concernés n ont pas encore aboutit à des explications probantes. Ainsi, le phénotype neurologique ne semble pas lié à une altération de l activité du canal, mais plus vraisemblablement à des fonctions cellulaires inconnues de Cavb4. Ma thèse porte sur la caractérisation des déterminants moléculaires et cellulaires du mutant humain R482X impliqué dans le phénotype neurologique des patients qui portent la mutation. Etant donné que l épilepsie implique essentiellement les neurones du lobe temporal, je me suis particulièrement intéressée à l étude des fonctions et de la localisation de Cavb4 dans les neurones d hippocampe. Dans ces cellules, une translocation de la sous-unité Cavb4 du cytoplasme vers le noyau est notée au cours de la différenciation neuronale. Cette translocation est dépendante de l intégrité structurale de la sous-unité Cavb4, elle est perdue dans le cas de la mutation R482X. La perte du fragment carboxy-terminal conduit à une altération de la structure de Cavb4 suite à la rupture de l interaction intramoléculaire entre les deux domaines conservés, au sein de la protéine native. Dans les neurones d hippocampe, cette déstructuration empêche la localisation nucléaire de la protéine mutante. Etant donné que la sous-unité Cavb4 ne possède aucun signal d adressage nucléaire, la technique du double hybride a été réalisée afin de déterminer les partenaires protéiques capables d adresser la sous-unité Cavb4 vers le noyau. Parmi les trois protéines criblées qui interagissent spécifiquement avec Cavb4 et pas avec le mutant, une est capable d adresser Cavb4 dans le noyau alors que l autre la retient dans le cytoplasme. Afin d étudier l effet de la localisation nucléaire de la sousunité Cavb4 sur la régulation génique, une étude transcriptomique a été réalisée. La sousunité Cavb4 montre un effet répressif sur l expression génique. Cette répression est inversée dans le cas du mutant incapable de s adresser vers le noyau des neurones. Parmi ces gènes, plusieurs sont des candidats potentiels pour expliquer l altération d activités neuronaux impliquée dans le phénotype épileptique. Enfin, l absence de l adressage nucléaire de la sous-unité Cavb4 mutante (R482X) due à la déformation de sa structure native, altèrerait la régulation transcriptionnelle des gènes, qui serait à la base du phénotype épileptique des patients qui portent cette mutationHigh voltage-activated (HVA) calcium channels are hetero-multimeric complexes that translate electrical signals into Ca2+ influx, a secondary messenger that mediates essential neuronal processes such as neurotransmitter release and neuronal excitability. HVA calcium channels are composed of four subunits: Cava1 subunit, the pore forming of the channel and the auxiliary subunits Cavb, Cava2 and Cavg. The Cavß subunit has focused much of the interest owing to its regulatory functions within the complex. By masking an endoplasmic retention signal on the Cava1 subunit, Cavß subunit targets the mature calcium channel to the plasma membrane and contributes to the increase in number of functional calcium currents. In humans, pathologic mutations have been identified in CACNAB4 that produce epileptic phenotype. One of these mutations is a premature termination mutation (R482X). Mutations produced minor biophysical effects on calcium channels in spite of their preponderant pathological phenotypes, which tend to indicate that cellular functions other than channel regulation may be responsible for the predominant neurological effects of the R482X mutation. My thesis focuses on the molecular and cellular determinants of the Cavb4 mutant (R482X) inducing the human neurological phenotype. Studies were realized in hippocampal neurons which are particularly implicated in epilepsy. A translocation of endogenous Cavß4, from the cytoplasm to the nucleus is observed during neuronal differentiation and synaptogenesis. This translocation is conditioned by the native structural conformation of Cavß4 subunit; carboxy-terminal deletion inhibits the nuclear localization of the mutant. The 38 amino acids deletion disturbs the structure of Cavß4 by altering the intramolecular interaction between the two conserved domains in Cavß4 subunit. In hippocampal neurons, this structural distortion prevents the nuclear localization of the mutant Cavß4. In order to identify the impact of the nuclear localization of the Cavß4 subunit on transcriptional regulation, a study on gene expression generated by microarray is realized. Profiles of gene expression revealed a differential gene regulation between wild-type and mutant Cavß4. Cavß4 subunit seems to have a repressive action on gene regulation; on the other hand, the lack of nuclear localization of the mutant reverses this repressive impact. Among the specific transcripts differentially expressed, some genes are primordial keys in neuronal activities, thus alterations in the regulation of these genes could be involved in neuronal diseases. Since no NLS consensus sequence has been identified on Cavß4, two-hybrid assay was realized in order to identify partners responsible of the Cavß4 nuclear targeting. A specific protein holding a NLS sequence interacts specifically with Cavß4 subunit, but not with the mutant, and is able to target Cavß4 to the nucleus. The other protein which specifically interacts with the WT Cavß4 sequesters Cavß4 in the cytoplasm. Finally, the lack in nuclear targeting of the R482X mutant due to the structural distortion appears to alter the transcriptional gene regulation which is maybe implicated in the epileptic phenotype of patients holding the mutationGRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF