Caractérisation de mutants de Leptosphaeria maculans obtenus par agrotransformation et affectés dans leur pouvoir pathogène

Abstract

Leptosphaeria maculans est l ascomycete responsable de la maladie la plus dommageable sur colza, la nécrose du collet. C est un champignon hémibiotrophe au cycle parasitaire complexe et exemplaire des stratégies d infection des Dothidéomycètes. Le déterminisme moléculaire du pouvoir pathogène de L. maculans est actuellement mal connu et seuls deux gènes impliqués dans le pouvoir pathogène étaient décrits et validés au début de cette thèse. De façon à accroître notre compréhension du déterminisme du pouvoir pathogène, une stratégie de mutagenèse insertionnelle aléatoire via Agrobacterium tumefaciens a été mise en place. L intérêt de cette approche pour l identification de mutants affectés dans leur pouvoir pathogène et étiquetés a tout d abord été validé, puis nous avons développé une analyse phénotypique et moléculaire plus détaillée de trois des mutants de la collection.Les trois mutants sélectionnés (m210, m20 et m186) sont non pathogènes et affectés à des étapes différentes du processus infectieux : la phase de germination à la surface de l hôte pour m210, la phase de colonisation biotrophe pour m20 et la transition biotrophie-nécrotrophie pour m186. Pour chacun des mutants, une intégration unique de l ADN-T a été mise en évidence. Dans les trois cas, celle-ci a eu lieu dans des régions promotrices, conduisant à une dérégulation de l expression des gènes adjacents au site d intégration (sur-expression pour m186, réduction de 40% pour m210, sur-expression in vitro et sous-expression in planta pour m20). L implication de chacun des gènes responsables du phénotype mutant, ainsi que leur fonction et leur rôle dans le pouvoir pathogène ont ensuite été analysés par différentes approches (bio-informatique, complémentation fonctionnelle, silencing, etc ).The Ascomycete Leptosphaeria maculans is responsible for the most damaging disease of oilseed rape (Brassica napus), stem canker. This hemibiotrophic fungus possess a complex parasitic cycle and is representative of Dothideomycete infection strategies. The molecular determinism of L. maculans pathogenicity is currently poorly understood with only two pathogenicity genes described and validated at the beginning of this thesis. Thus, the first objective of this PhD was to initiate a random insertional mutagenesis strategy using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation in order to increase our knowledge on L. maculans pathogenicity factors. We first validated the robustness of this approach to identify loss-of pathogenicity tagged mutants, then we performed a more detailed phenotypic and molecular characterisation of three mutants of the collection. The three non pathogenic mutants selected (m20, m210 and m186) are affected in three different steps of the infection process: the germination phase on the host surface for m210, the biotrophic colonisation phase for m20 and the switch between biotrophy and necrotrophy for m186. A single copy integration event of the T-DNA occurred in each mutant. In addition, all integrations took place in promoter regions, leading to a deregulation of the expression of the closest genes (over-expression for m186, 40% reduction of expression for m210, and over-expression in vitro and reduction in planta for m20). Identification of the gene responsible for the mutant phenotype, along with its intrinsic function and role in pathogenicity were then analysed using various approaches (bioinformatics, functional complementation, silencing, etc...).ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF